【求助】请教蛋白浓度测定中的BSA标准问题

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标题:【求助】请教蛋白浓度测定中的BSA标准问题

ALALA[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在想用bradford法测包涵体蛋白的浓度，用6M盐酸胍溶解BSA做标准曲线，以6M盐酸胍做空白对照。一般来说，1mg/ml BSA的OD280=0.67，但我配制的1mg/ml BSA OD280=0.75，这是盐酸胍对吸光度有影响导致的，还是配制误差（不过我觉得我们的分析天平是很准的）。
是否应该根据二者的比值，修正我配制的1mg/ml BSA的浓度为1.12mg/ml（0.75/0.67）；还是应以实际测定的BSA浓度梯度绘制标准曲线？如果是这样，给出1mg/ml BSA的OD280=0.67的标准在bradford测定中有什么意义？
谢谢！

小糖块[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果你认为操作和称量过程没问题的话，我觉得没必要修正
因为盐酸胍处理BSA和样品和平时用其他试剂处理的结果不具可比性
另外，蛋白定量本就是根据BSA的曲线和吸光值来定含量，相当于解直线方程，蛋白和BSA在一个系统中处理，减少了条件误差，其结果是可信的。何况0.75/0.67的差别还是可以接受的。

ALALA[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天我也请教了一个做过bradford法测定的同学，他认为，之所以给出1mg/ml BSA的OD280=0.67的标准，就是对你自己配制的1mg/ml BSA进行重新标定，以减少系统误差，可以多做几个BSA稀释度，测OD值，与标准相比较。具体到本次试验，应该修正所配制的1mg/ml BSA的浓度为1.12mg/ml，再进行下面的测定。
不知这样的说法是否正确，请战友们参与讨论。

am10[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

觉得没有必要这么究。理论上当然如你所说，修正一下。但如果OD落在0.67~0.75 这个线性范围就可以了，这种测蛋白的方法也不是精确到这么一点小差别都不可忍受的，也就是说即使修正了，难保该方法不产生更大的误差。

glass[使用道具]
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发表于 2013-4-23 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我认为没有必要修正，这个偏差很可能是实验的系统误差（分光光度计，试剂等引起的）。如果不放心的话，再重新配个1mg/ml的BSA测测看。

yonger[使用道具]
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