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标题:【求助】求助关于细菌膜蛋白或外膜蛋白提取的方法

abc816[使用道具]
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【求助】求助关于细菌膜蛋白或外膜蛋白提取的方法

分离细菌外膜蛋白的方法(引自论坛中):
① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌,37℃,200rpm。
② 10000g、20min、4℃离心,去上清。
③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬,同样条件离心,再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
④ 超声波破碎细菌。
⑤ 3000g,10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清(含有胞质成分和细菌外被成分)。
⑥ 超速离心I:100,000g,60min,4℃,去除上清(胞质成分),收集细菌外被成分。
⑦ 用10ml含2%的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物,室温温育20-30min。
⑧ 超速离心II:70,000g,60min,室温沉淀收集外膜蛋白,去除上清(含细胞质膜)。重复⑦、⑧两步。
⑨ 充分吸除上清,并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式:蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度,调节蛋白浓度至40ug/ul,该蛋白质样品-70℃贮存。
试剂
① Tris-Mg 缓冲液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3,4℃保存
② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)

请问细菌外膜蛋白提取中加Tris-Mg缓冲液和SLS的原理是什么?
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abc816[使用道具]
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另外我在一篇文献中看到加NaCO3(PH11)后超速离心,再加Tris-HCl超速离心来提细菌膜蛋白,请问为什么要加NaCO3和Tris-HCl?谢谢!
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INK[使用道具]
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NaCO3(PH11),在此 High-pH下超速离心即可获得细胞膜片,再用Tris-HCl洗去痕量的可溶性蛋白。另外,高pH的处理可以 disrupts sealed membrane compartments without
solubilizing or denaturing the lipid bilayer to allow mapping of the soluble domains of integral membrane proteins,结合LC MS/MS就能基本定位内膜蛋白的“真实”位置。


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2013-4-23 17:43
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abc816[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 INK 于 2013-4-23 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

NaCO3(PH11),在此 High-pH下超速离心即可获得细胞膜片,再用Tris-HCl洗去痕量的可溶性蛋白。另外,高pH的处理可以 disrupts sealed membrane compartments without
solubilizing or denaturing the lipid bilayer to all ...

谢谢!另外你能告诉我这篇文献的出处吗?
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回复 #4 abc816 的帖子

来自john yates的经典文章。
nature biotechnology volume 21 may 2003
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INK[使用道具]
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有好几篇文献都用过类似的方法,michael11说的牛文是这篇: < MS to membrane proteomics>
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lxh031[使用道具]
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适合大肠杆菌?
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eric930[使用道具]
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各位,大家好,不知是否有人知道如何进行亚细胞结构的分离,就是将细胞分为胞浆部分和颗粒部分,从而做western.现在很急
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eric930[使用道具]
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大家好,不知有人知道如何进行亚细胞结构的分离吗?我看到的一片文献是将细胞放入特定缓冲液中进行超速离心,分成胞浆成分和颗粒成分,从而可以分别提取核蛋白核胞浆蛋白。不知还有没有其他的一些方法。
不知怎么贴,就放这了,谢谢
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flower-201[使用道具]
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你可以参考肝微粒体的制备方法看看
主要就是利用在不同的缓冲液中的比重不同
然后利用高速离心分离
一般都能保持蛋白的活性和亚细胞结构
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