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标题:【求助】western 的转膜条件和转膜时间如何确定？

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发表于 2013-4-24 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western 的转膜条件和转膜时间如何确定？

最近在做western，做的是糖基化蛋白，分子量大概在70kd 55kd 37kd左右
配胶，上样量都没问题，内参孵出来很齐
电泳：70v 30min +100v 60min
0.45um的PVDF 转膜
电转：200mA 100min
封闭1h
一抗浓度：按前人的经验做，验证没问题
TBST:5min 3次
二抗：1:5000 浓度没问题
TBST：5min 3次
目的条带总是出不来。
请教各位，是不是我的转膜时间太长了，转膜的电流和转膜时间是怎样的关系？？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-4-24 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

凭我的经验是：转膜时间没问题，不知道你的蛋白表达量高么？如果是表达量低的问题你可以尝试做做Elisa或者dot blot。
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发表于 2013-4-24 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pengke1983 于 2013-4-24 14:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

凭我的经验是：转膜时间没问题，不知道你的蛋白表达量高么？如果是表达量低的问题你可以尝试做做Elisa或者dot blot。

如果电泳和电转条件都没有问题的话，那是不是我的样品问题，因为我从六孔板（瞬时转染的肿瘤细胞）上提蛋白的时候，加了裂解液（RIPA:PMSF=100:1），每孔加200ul ，之后液体变成粘稠的鼻涕样，14000 g 离心30分钟 没法离心出沉淀。之后拿去超声，蛋白样品就没有那么粘稠了，之后就没有再离心，BCA测蛋白浓度特别高，70ug才加3ul左右。之后加了loading buffer 煮沸5min后上样。这样看来，是不是问题出在我的样品上，是不是我的样品不纯？？RIPA用的是碧云天的强裂解液，PMSF是自己配的。为什么每次裂解蛋白都是鼻涕样的呢？？
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发表于 2013-4-24 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你试过洗涤细胞后 直接煮样 进行wb么？
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发表于 2013-4-24 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pengke1983 于 2013-4-24 14:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你试过洗涤细胞后 直接煮样 进行wb么？


没有试过，细胞需要消化下来吧？具体是怎么操作的？？
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发表于 2013-4-24 15:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对胞内表达蛋白（且上清中），我们实验室当时简易的wb检测就是EP管取细胞液；1000g离心取培养基后,以PBS洗涤3次（1000g离心）；就可以直接煮样进行wb了，很简单，而且效果都不错。具体你去看看wb的专业介绍吧。
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 小中大

打错一个字，不是“取”培养基，是“弃”培养基。
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发表于 2013-4-24 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对胞内表达蛋白（且上清中），我们实验室当时简易的wb检测就是EP管取细胞液；1000g离心取培养基后,以PBS洗涤3次（1000g离心）；就可以直接煮样进行wb了，很简单，而且效果都不错。具体你去看看wb的专业介绍吧。

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我做的目的蛋白是膜蛋白。。。所以这个方法也一样适用吗？
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发表于 2013-4-24 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该可以，当时我们实验室有一些做家蚕膜蛋白在细胞中表达的 都是这样wb的
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 小中大


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原帖由 pengke1983 于 2013-4-24 15:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对胞内表达蛋白（且上清中），我们实验室当时简易的wb检测就是EP管取细胞液；1000g离心取培养基后,以PBS洗涤3次（1000g离心）；就可以直接煮样进行wb了，很简单，而且效果都不错。具体你去看看wb的专业介绍吧。 ...

还有一个问题，就是直接加1x的loading buffer 煮样吗？？六孔板的一个孔加多少量，100ul？？还是200ul？？
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