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标题:【求助】SDS-PAGE显示“共价二聚体”形式分析求助

langlang[使用道具]
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发表于 2013-4-24 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE显示“共价二聚体”形式分析求助


近期纯化一蛋白时发现一怪现象，SDS-PAGE电泳时有一条分子量为目标蛋白两倍的条带，含量占主带1%-2%。该条带经WB和质量肽图分析，确认为相关蛋白；还原前后仍存在，暗示该条带与二硫键无关，应为共价偶联形成的二聚体条带。3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用，怀疑为N端NH2与C端COOH偶联所致；但该条带在水溶液放置过程中慢慢增多，理论上讲在水溶液中COOH很难和NH2形成酰胺键，只有在缩合剂DCC，DIMP等存在下才可催化此类反应，但储存溶液中无此类物质，难以解释；故怀疑为蛋白N端与C端超强非共价作用力（离子键、氢键、疏水作用力等共同作用）所致，但理论上讲SDS可以破坏此类作用力，即使不能破坏，该条带也应该恒定，而不应随着放置时间的延长而逐渐增多。该条带含量极少，手头所有的纯化方法均不能有效将其与主带分离，只能通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%。该条带颇诡异，请大家一同分析！
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发表于 2013-4-24 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 langlang 的帖子

langlang兄试验室条件不错啊~~3D结构是做的什么得到的结论？

水溶液？应该不是纯水吧，是什么缓冲液？通过你试验结果看单体和二聚体应该是保持在某一平衡？

该蛋白天然情况下是否存在多聚体？

另外你应该是做得基因工程获得的重组蛋白吧，N端或C端加了什么修饰？有没有加什么tag？

[ 本帖最后由 NBA 于 2013-4-24 15:20 编辑 ]
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发表于 2013-4-24 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还原前后仍存在

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相关疾病：
乙型肝炎


楼主兄的意思是说分别做过还原型和非还原型的SDS-PAGE？

这种情况我确实也遇到过的，对此也曾做过一些思考。

以前做过原核表达的IFN-gama，最后产品的电泳即有此现象。这是一个正式生产的药用蛋白，通过了各种报批审核，所以是与试验条件无关，是客观存在的。而Human IFN-γ分子中无Cys，所以IFN-γ这种SDS-PAGE表现出来的二聚体、三聚体肯定是与二硫键无关。

乙肝表面抗原（HBsAg）电泳也常见此现象。

印象中重组人TNF（肿瘤坏死因子）也是有此现象的。

我不同意火箭兄例子“共价二聚体”的说法。

我瞎猜猜看，夹杂着做一些假说来讨论。

蛋白中存在着二硫键、非二硫键、杂合三种多聚体，这些多聚体在一定程度上与单体蛋白间形成一个聚合和分离的动态平衡。而聚合的作用力可能方式多样，聚合反应的平衡常数因聚合类型和蛋白种类而异。

二硫键多聚体很好理解。在还原型SDS-PAGE中，这种多聚体可以认为完全打开。

非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。在电泳中，打开这种多聚体的力就是SDS。SDS作为表面活性剂，很有效地对付蛋白质中的疏水作用，但不是万能。

打个比方，无论那一种商品化的蛋白质提取试剂，（也就是一些含有表面活性剂、变性剂、还原剂、螯合剂、抑制剂等的缓冲溶液），都不能将一块组织中的所有蛋白溶解提取出来。这里面有作用力方面的原因，也有动力学的因素。

蛋白质的相互作用，并非那么单一。

你的例子，我想做这样一个假说解释。

1、原始样品中有单体，也有非二硫键形式的二聚体（应该也有三聚体、四聚体等，只是量少，检测不到）。

2、这种二聚体并非共价型的，它和单体间相互移动平衡。在不同的体系中，平衡会移动。例如水溶液中，二聚体会增多。慢慢增多的现象是受到动力学的制约。

3、SDS不能将这种二聚体完全打开。初始样品电泳表现为1-2%。

4、制备电泳切胶获得的虽然当时全部是二聚体，但是在提取后，在溶液中新的平衡形成，二聚体部分转化为单体。或许是受到动力学的制约，电泳表现为50%。

5、大胆预测1：制备电泳获得的纯单体蛋白，重新电泳，也会有二聚体条带出现。

6、大胆预测2：制备电泳获得的单体及二聚体蛋白，如果放置时间足够长，使得平衡完全，那么，它们的电泳行为应该很接近，二聚体的比例恒定。

很好的话题，其它请各路好手讨论。
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 小中大
呵呵，我们实验室条件非常一般，有一些实验是委托别人做的。本来想直接用晶体结晶X衍射的方法拿到它的真正的3D结构，但是无奈该蛋白溶解性极差，各种缓冲都实验了，仍然无法得到结晶。
目前的3D结构是通过同源建模构造的，虽然某些氨基酸的位置与实际的结构有些偏差，但是N端与C端的大体位置和相互作用力还是能较准确反映实际情况的。
我的蛋白天然情况下是多聚体，单体之间无二硫键仅仅通过疏水作用力缔合在一起；在多聚体情况下，一单体的N端与另一单体的C端靠的很近，3D结构显示有很强的相互作用力；这种二聚体的形成为活性形式（可以和亲和层析填料结合），存在于多聚体内部，只是对现有多聚体结构起到了加固的作用，对多聚体结构功能无任何改变；
我们的蛋白是重组蛋白，N端和C端无任何修饰，N端测序显示实际结果与理论序列完全一致；而且我纯化到了少量天然组织中存在的这种蛋白，天然提取蛋白SDS-PAGE显示仍然含有该条带，含量与重组蛋白相当；因此，推测这种结果绝非偶然，应该是具有一定的生物学作用的（如稳定四聚体结构等）。
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发表于 2013-4-24 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的觉得问题的关键是什么“力”使单体蛋白聚合成二聚体。至于为什么不是三聚体四聚体或者有但含量低，暂不作考虑。
“3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用”
这个3D结构是测的单体的还是二聚体的？这不是问题的关键，随便问问。
1.二聚体条带随着放置时间的延长而逐渐增多。增加到多少的时候不再变化？这个楼主可以试试。

2.“但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带，其含量与多聚体条带含量各占50%”根据这个条件我猜测在溶液中二聚体增加到与单体各占50%时不再增多。

3.“通过制备型SDS-PAGE电泳的方法慢慢收集，切胶时已确保收集条带无单体蛋白干扰，但通过切胶收集的二聚体条带重新电泳后竟重新出现单体条带”通过这条推断，SDS无法阻止单体向二聚体转换，也无法阻止二聚体向单体的逆向转换，所以SDS不是阻止这个“力”的合适试剂。

相互作用的力嘛，我猜可能是N、C端羟基羧基的相互作用，也可能是附近的氨基侧链相互作用，第二条是瞎猜的，没看过有相关报道。

接下来的实验建议：
1.用电泳测定在溶液中二聚体最终会增加到多少浓度。单体聚合成二聚体也是个反应，所以该看看这个反应的结果如何，多长时间达到平衡完成反应。进一步实验可以研究其他条件对反应时间甚至反应平衡结果的影响。

2.用不同的试剂阻止单体向二聚体聚合，这是关键了。除了SDS，巯基乙醇、DTT、Triton、吐温、尿素、盐酸胍、硫酸铵、甚至有机溶剂等。某种试剂阻止了聚合才好判断是什么力让单体聚合的。

核磁或者其他检测手段都不能判断结合的位点在哪里是吧？这个不了解。知道了结合的位点才是根本地解决了这个问题。

对聚合体蛋白了解不多，凭自己想象乱说几句，呵呵

祝顺
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发表于 2013-4-24 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 131415 于 2013-4-24 15:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的觉得问题的关键是什么“力”使单体蛋白聚合成二聚体。至于为什么不是三聚体四聚体或者有但含量低，暂不作考虑。
“3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用”
这个3D结构是测的单体的还是 ...

“非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。”这个也是目前我认为最有可能的结果，只是没遇到过其他例子，现在看这种现象应该是较普遍的，即SDS-PAGE无法完全打开某些强非共价作用力结合在一起的蛋白，让其被误认为是共价形式二聚体。这个可能是我们目前SDS-PAGE的一个限制，也许在这方面综述中，国外大牛应该会有较详细论述，近期我会查阅一下相关文献。有了新的进展，会与大家汇报。
5、大胆预测1：制备电泳获得的纯单体蛋白，重新电泳，也会有二聚体条带出现。
由于SDS-PAGE电泳后蛋白变性为单体，这时单体间N端和C端距离很远，这种相互作用力已消失，因此我们收集的单体蛋白条带中无二聚体条带。

6、大胆预测2：制备电泳获得的单体及二聚体蛋白，如果放置时间足够长，使得平衡完全，那么，它们的电泳行为应该很接近，二聚体的比例恒定。
电泳制备的缺点就是破坏了天然构想，打破了这种平衡，现在正在再次确认二聚体条带是否可向单体条带转化，目前正将同一样品反复收集，在确保无单体条带干扰的情况下，看这种二聚体向单体的转换是否存在
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 小中大


QUOTE:
原帖由 131415 于 2013-4-24 15:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的觉得问题的关键是什么“力”使单体蛋白聚合成二聚体。至于为什么不是三聚体四聚体或者有但含量低，暂不作考虑。
“3D结构显示一单体的N端与另一单体的C端距离很近，有很强的相互作用”
这个3D结构是测的单体的还是 ...

呵呵，两种蛋白之间确实存在一种联系。但是有一点我没有跟大家讲清楚。这个蛋白活性形式是多聚体，多聚体情况下好像单体可以慢慢向多聚体转换，但是SDS-PAGE胶回收时，已将蛋白变性，打成单体，即便回收回来，单体仍然无法形成多聚体活性形式，这种关系已打破，单体无法继续向二聚体转换，但是，二聚体好像可以逐渐断裂成单体（目前结果显示），据此判断，这种二聚体应该不是共价作用力形成。
3D结构检测的是多聚体结构，多聚体中包含有这种二聚体异构，3D结果显示一个单体的N端与另一个单体的C端平行排布，有10多个氨基酸可以相互作用，这种作用力应该是很强的。
单体向多聚体转换，何时达到平衡这个我们没有仔细研究过，只是在放置的过程中发现二聚体含量略有增多。
其他的如尿素、盐酸胍等变性剂和还原剂都实验过，上述二聚体仍然存在，有机溶剂和其他的去垢剂倒没有实验过，后期会尝试一下。
目前我的重点确实是判断结合位点在何处。通过质量肽图分析多聚体条带和单体条带，根据酶切肽段差异，并结合分子量应能判断结合位点，这也是我用SDS-PAGE胶回收纯化二聚体条带的目的，但是目前没有得到纯度足够高的二聚体条带，目前这个方法也正在实验！
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发表于 2013-4-24 15:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个现象的确很有意思，如果确认那条条带是目的蛋白质，则无疑是个二聚体。

如何连接在一起的呢？我也赞成这楼上各位最后总结认为 “非二硫键多聚体有些复杂。虽然在绝大多数蛋白电泳的表现中，它可以打开，但是我认为达不到全部，或者说会受到动力学方面的限制。”。

另外在 Methods in Molecular Biology （Vol 1 , page 53）的一篇文章里有写，我更觉得，那是极有可能的事情。

fault: Bands have become smeared or streaked.

cause: Proteins in the sample are insoluble or remain aggregated in the sample solvent.

remedy: Use fresh sample solvent and/or extra SDS and reducing agent in it (especially for concentrated sample solutions)

作者也认为蛋白质在上样缓冲液中没有被全部打开是可能的。

另外，langlang兄能否把这个“源”的两个单体的 N端C端之间的部分画个图，看看他们到底是怎样的相互作用。

还有，langlang兄说，这个蛋白质溶解性很差，是指表达成了包涵体，还是说结晶的时候极易沉淀而不能结晶？那么电泳的时候，使用的是包涵体还是溶液？包涵体的话，可能相互之间的作用不是NC末端的相互作用了，因为如果构象破坏，他们可能不能轻易聚头。
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发表于 2013-4-24 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
NC端相互作用图谱见下图，蓝色为一个单体的N端，红色为另一单体的C端，各标识了10个左右氨基酸，可以看到他们是平行排列，有很强的相互作用。
蛋白表达后为可溶性形式，溶解性差是指活性蛋白在结晶过程中聚集沉淀了，没有得到结晶。
现在感觉这种现象应该比较普遍，近期会改变样品处理条件后再进行SDS-PAGE分析，看是否有变化。


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 小中大


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原帖由 langlang 于 2013-4-24 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
NC端相互作用图谱见下图，蓝色为一个单体的N端，红色为另一单体的C端，各标识了10个左右氨基酸，可以看到他们是平行排列，有很强的相互作用。
蛋白表达后为可溶性形式，溶解性差是指活性蛋白在结晶过程中聚集沉淀了，没有得到结晶 ...

说老实话，看不太清这个图，仔细分辨了一下，是不是黄色的 dash 代表氢键？ 貌似他们之间有四个氢键?
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