【求助】dominant negative及在蛋白质功能研究中的应用

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标题:【求助】dominant negative及在蛋白质功能研究中的应用

bananapeople[使用道具]
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发表于 2013-4-24 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想和大家讨论一下关于dominant negative的问题。

首先，什么是dominant negative？
在网上查到的解释多为：显性抑制---虽然多数的突变都隐性的，可是在遗传学的实验上，也曾观察到显性的突变，如果这突变会抑制或破坏某一正常的功能，就称之为“显性抑制”。
在实验中给野生型表达或转入无功能的基因或目的蛋白无功能类似物，观察是否会影响原来也具有正常功能的基因或蛋白的作用。一般用于验证实验的准确性。

就我的理解，dominant negative指的是某种蛋白的突变，而该突变导致了该基因的失活。说得再通俗点，就是蛋白A发挥正常功能，但当蛋白A发生dominant negative突变，或者说在细胞内存在蛋白A的dominant negative突变后，蛋白A就失去了功能。另外，只要存在dominant negative突变了，那么即使仍然还有正常的蛋白A，也不发挥作用了。

那么这种突变在研究蛋白质功能方面就具有了很重要的作用了。说白了，就是一种基因Knockout的方法。
研究某基因功能，通常的方法包括：
1。给与特定刺激，基因表达量改变；
2。Knockout或Knockdown该基因，再给与刺激，功能消失；
3。Rescue或Overexpression

其中第二步Knockout是很重要的一步。以前大多研究采用基因双交换的方法将该基因替换为某些报告基因比如抗性基因，使得该基因敲除，但是操作麻烦，而且如果敲掉的基因内部存在调控其它基因的元件则必须再做互补试验确证；新出现的RNAi技术具有很好的应用前景，操作简便，但是也存在着问题，许多细节还不是很清楚，另外RNAi大多为Knockdown而不是Knockout，也就是仍然会有少量基因表达，也是个问题。

因此dominant negative也是一种可以考虑的knockout的补充方法。这种方法并不是现在才有的，已经应用了很长时间，但是没有流行起来，究其原因，可能由于大多数基因并不具有天然的dominant negative的形式，如果去筛选突变将是很大的工作量（虽然如果得到一种dominant negative的话，这种基因的研究工作将会非常简便且明确，但是很少有人去尝试。。。。）。那么有没有更简便的方法去得到dominant negative？

因此想和大家讨论一下关于dominant negative的应用的问题，欢迎大家发表意见！

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发表于 2013-4-24 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先个人的一些想法，欢迎大家指正：

如果要研究的目的蛋白是个多次跨膜受体，那么如果转入去掉一次跨膜段的蛋白，但仍保留配基结合位点，那么是否能算作是一种dominant negative？比如常提到的白介素受体，在体内存在可溶性的白介素受体，与膜上受体竞争结合配基而导致膜上的受体失去功能，这种算不算dominant negative？当然，这个可能更属于Knockdown而不是Knockout，有点类似RNAi，但也是一种研究基因功能的方法，比如在正常细胞中转入某种跨膜受体的截短的蛋白来研究该蛋白功能？

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发表于 2013-4-24 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

dominant-negative的意思我想楼主的解释不够准确与完善
这个概念源自于遗传学
从字面上理解，一个基因的两条等位基因中，有一个等位基因发生突变就能造成疾病（或者产生异常的生物学效应），那么这种突变称之为显性的（dominant），常染色体显性遗传病的基础一般都是显性突变。
而这种突变的蛋白如果能够影响到正常蛋白的功能，那么其效应应该是“负”的（negative），此类突变就被称之为显性负效应突变 dominant-negative mutation

dominant-negative效应只是显性突变机制中的一种，这种突变的蛋白往往不会降解，而且能与野生型的蛋白结合从而导致野生型蛋白的功能改变或者丧失。

dominant-negative效应有三个必须的条件，一、突变是显性的，也就是生物体内基因组上野生型的等位基因与突变的等位基因分子数为1：1；二、突变不能影响mRNA以及成熟蛋白的稳定性，也就是突变的蛋白亦会表达；三、突变的蛋白一定要与野生型蛋白相互结合（或者称之为直接作用）而且影响到野生型蛋白的功能，这种结合不一定是1：1，也有可能是1：2或者2：1或者其他比例，视蛋白的结构功能而定。

最典型的例子就是各类自身会形成多聚体的蛋白，以二聚体蛋白为例，无论是体外实验还是体内，如果突变的蛋白与野生型按1：1进行相互作用的话，能检测到的正常蛋白的功能通常要远远低于正常的50%，这是因为突变蛋白无论与野生型还是突变蛋白自身结合，最终都将是功能丧失，而正常野生型与野生型蛋白结合的比例将会非常的少，不足以支撑正常的生物学功能。

对这种突变效应的研究有很多年历史了，像JBC， Nucl Acids Res，Am J Hum Genet等杂志上都能搜到多篇关于这方面的研究

我想研究手段要从两个方面下手：
1.突变的蛋白有表达
2.突变的蛋白能与野生型蛋白结合，并影响野生型蛋白的功能

第一点比较好说，过表达做western就可以
难点在于第二点，如果做体内实验，提取蛋白往往会使多聚体蛋白解聚，体外的实验更多些，一般都是构建突变和野生型蛋白在体外相互作用，但又与细胞内环境差别太大

我本人不是做蛋白功能的，所以对蛋白相互作用这块说不出太多所以然，还请各位蛋白高手来共同讨论

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发表于 2013-4-24 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢楼上的指正！请教一下，下面这篇文章中提到的dominant negative 是否算是dominant negative？因为体内是否有该蛋白的突变并没有证实，因此称为dominant negative form？

cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19116451?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum')

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发表于 2013-4-24 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这篇paper里面提到的dominant-negative应该算是显性负效应概念的一种延伸（results的第一部分）
作者的主要意思是
1.CD36的一系列截短突变都有表达
2.突变的CD36能与野生型CD36竞争性结合OxLDS，从而抑制OxLDL介导的下游HSP70的表达
这种效应其实是可以称之为dominant-negative的

经典的dominant-negative mutation都是指突变的蛋白能直接与野生型结合，也就是自身之间的相互作用，而这篇文章的意思是突变蛋白A能与野生型A竞争性结合蛋白B，属于不同蛋白之间的相互作用。我想两者表面不同，但作用机制是一样的，因而可以说是dominant-negative效应

我是做遗传的，以前看的做mutation功能的基本上都是经典的，看到这篇paper也觉得很新鲜，扩展了思路哈，呵呵，互相学习

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发表于 2013-4-24 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

dominant negative我们这里的翻译是显性阴性。做血小板中的integrin分子经常要用显性阴性的模型的。

把integrin胞外段用IL-2Rα(Tac)的胞外段取代，就成了dominant negative。

具体的细节我也不清楚。

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发表于 2013-4-24 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这种dominant negative的技术在植物中已经开始应用了，这要归功于植物中EAR motif功能的发现。

在植物中，主要用于有功能冗余的转录因子的功能鉴定。这项称为chimeric repressor silencing technology (CRES-T)的技术已成功应用于拟南芥和水稻中。

更多信息见：cuturl('http://www.cres-t.org/index_e.html')

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发表于 2013-4-24 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Small的专题讨论一定要支持一下！这方面了解的不多，只知道好多转基因动物都开始引入此方法。

学习一下原理。

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发表于 2013-4-24 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
头痛
新的基金正在申请，估计也要做RNAi干扰了。我是做IKKβ的基因敲除。
按生物公司的说法有几种方法来敲除，一种就是腺病毒载体构建表达显性负相的IKKβ。还有一种是直接合成小的RNAi短片断给我们，而不用再靠转染载体表达。
我看的文献关于显性负相的原理比较局限。例如我的课题，
dn-IKKβ敲除IKKβ的原理是通过同NEMO（调节亚基）竞争性结合，使野生型的IKKβ无法与NEMO结合而发挥作用。
关于体内实验，我也很头疼。在体内复杂的大环境内是否会在目标脏器里正常表达。而合成的RNAi片断虽说有修饰，可以防止降解。真拿不定主意用那种。
惹恼了我用药物干预的方法，直接腹腔注射，省事！

我佛慈悲[使用道具]
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发表于 2013-4-24 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在构建的一个突变体，如果成功的话，应该就是dominant negative．
这个技术其实已经存在很多年了。举个例子可以更好的理解。
很多酶都有结合位点和催化位点，这两个位点在不同domain。如果把一个酶的催化位点定点突变掉，这种酶就会失去催化活性，但是其他功能不变。这种变变了的酶仍然可以结合底物，但是只结合不催化，相当于野生型的一种竞争性抑制剂，而且有些突变体结合底物能力比野生型更高。
信号通路中，很多受体结合配体之后可以结合并磷酸化下游蛋白，如果删除受体结合位点或者磷酸化位点，那也是一种dominant negative.
想要得到dominant negative,通过同源比对找出同源蛋白的保守催化位点并突变掉，是简单可行的方法之一。

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