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标题:【求助】原核表达包涵体问题

star#room[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达包涵体问题


小弟在做原核表达。用的是pet-28a和BL21（DE3）。OD0.5-0.6时开始诱导，IPTG浓度有1mM 0.5mM 0.1mM 0.05mM 0.01mM，诱导温度有37度，30度，25度，20度，16度，诱导时间从2小时到18小时，诱导转速250转，诱导时每个250毫升的三角瓶中有100毫升的培养液。培养液LB或NZCYM都用过。这个蛋白有8个半胱氨酸。破碎用的缓冲液为PH7.4的PBS（含有百分之一的Titon X100）
跑胶后发现上清中目的蛋白很少，基本上都以包涵体形式存在。目测观察包涵体的量大约为上清中目的蛋白量的5倍以上！
请问各位大虾我该怎么办？如果换载体的话，哪种载体比较好？谢谢！
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

采用含有GST标签的PGEX系列载体试一试，可以增加蛋白的可溶性表达，也可以联系上海生工帮我。
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发表于 2013-4-24 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

I noticed that you could get some soluble protein in supernatant(~10-15%). Therefore, it becomes important to think about what is the purpose to purify this protein.

If you want to do crystallization or NMR ，maybe it is worth to try to improve the soluble expression. But I strongly suggest to obtain enough protein simply by increasing the culture volume.

If you want to do some biochemistry experiments, it will definitely waste your time to search methods improving the soluble expression.
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发表于 2013-4-24 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 hot_hot_hot 于 2013-4-24 16:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

I noticed that you could get some soluble protein in supernatant(~10-15%). Therefore, it becomes important to think about what is the purpose to purify this protein.

If you want to do crystallizati ...

This protein is an enzyme that I want to reserch the catalytic activity. On the other hand, degeneration and renaturation of inclusion body is very difficult for my enzyme(I have tried).So I want to get enough soluble protein for purification. Whicht the common vector can decrease the amount of inclusion body and increase the soluble protein? What about pMAL vector? Thank you !
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发表于 2013-4-24 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 star#room 于 2013-4-24 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


This protein is an enzyme that I want to reserch the catalytic activity. On the other hand, degeneration and renaturation of inclusion body is very difficult for my enzyme(I have tried).So I want to ...

According to my limited experience, the problems in expressing heterogenes, such as expressing or not, soluble or not, are mostly depending on the intrinsic characterization of this protein. Occasionally, the expression level could be improved by adjusting in vivo (for EX. vector, host, code bias, codon optimization, truncation expression) or in vitro (medium, temp., air, agitation, inducer) conditions. It is very difficult to say which vector is the best. The only thing you can do is to try one by one. Of course, pMAL should be tried. According to the manufacturer, MBP will certainly improve the expression, but they have never guaranteed.
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发表于 2013-4-24 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Thank you for your advice. I will try another host which can express thioredoxin reductase and glutathione reductase. If the result are not good, I think I will change the vector or express my gene in Saccharomy cescerevisiae.
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 star#room 于 2013-4-24 16:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
Thank you for your advice. I will try another host which can express thioredoxin reductase and glutathione reductase. If the result are not good, I think I will change the vector or express my gene in ...

你也遇到了和我一样的问题？怎么弄上清都少？
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发表于 2013-4-24 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #7 nut6694 的帖子

对呀，复性效果也不好，都不知道怎么办了
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在表达纯化的蛋白也是一种酶，试过几次了，都是以包涵体形式存在的。师姐也建议我换个载体重新表达，可是我觉得很浪费时间，请问你与后来是如何让解决的呢？？？求建议~~~~谢谢~~
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-4-24 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 rxcc33 于 2013-4-24 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在表达纯化的蛋白也是一种酶，试过几次了，都是以包涵体形式存在的。师姐也建议我换个载体重新表达，可是我觉得很浪费时间，请问你与后来是如何让解决的呢？？？求建议~~~~谢谢~~ ...

现在在纠结阶段····我想换个载体继续原核表达，老师想让我做个真核表达···唉。你用的是什么载体啊？
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