【求助】WB问题求助曝光后内参始终为两条带

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】WB问题求助曝光后内参始终为两条带

16 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】WB问题求助曝光后内参始终为两条带

babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-4-25 13:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如下图（发白的地方是标签，请大家略过），浓缩胶5%，分离胶为12%，每次都是浓缩胶60v-80v，条带能压缩得很窄，但是在浓缩胶和分离胶的界限附件，电泳条带就会变成下面这样，溴酚蓝就会向下弥散，如下图

附件

2013-4-25 13:49

12159712.snap.jpg (49.46 KB)

babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-4-25 13:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

曝光后如下

求大虾指点啊，谢谢

附件

2013-4-25 13:50

82925958.png (11.58 KB)

2013-4-25 13:50

57925936.png (14.99 KB)

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-4-25 13:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两个问题：1.首先是胶的问题，可能是浓缩胶和分离胶的tris-HCl的ph有问题，建议重新调。

2.如果做的是胃，肠道等消化系统的组织蛋白，可能会出现两条带的。因为可能有其他物种的蛋白干扰，具体原因就不赘述了。如果是细胞，就是蛋白没提好，降解了，最后一种可能就是抗体有时候反复多次使用也会有这种结果。

babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-4-25 13:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-4-25 13:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两个问题：1.首先是胶的问题，可能是浓缩胶和分离胶的tris-HCl的ph有问题，建议重新调。

2.如果做的是胃，肠道等消化系统的组织蛋白，可能会出现两条带的。因为可能有其他物种的蛋白干扰，具体原因就不赘述了。如果是细胞，就是蛋 ...

1. 浓缩胶和分离胶使用的Tri-Hcl我使用过两个公司的成品，这个问题也曾想到过，2-3个月前曾经用PH计测定过，基本上没问题，但近期没有测定过，这个可能不能完全排除

2. 提取的是肾脏组织的蛋白，抗体存在反复使用的问题

另外，我还有一个问题，如果单纯是抗体反复使用造成这样的后果，那么怎么解释电泳时候条带弥散的问题呢？

谢谢你，非常感谢

yjf1026[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76421
精华 1
积分 497
帖子 670
信誉分 102
可用分 4116
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-4-25 13:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实一开始怀疑胶的问题，既然可能不是ph的问题的话，就看看你的loading buffer吧，有时候loading用久了，放在室温久了也会比较弥散的。
其实个人认为，弥散这个问题不是很大。一般不会影响蛋白。如果要解决，可以选择重配buffer

xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2013-4-25 13:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

溴酚蓝弥散问题确实不是个很大的问题。。。
你检测的蛋白是什么？它会不会本来就有两种形式？比如LC3，它本来就有两条带，很像你这种情况。

babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-4-25 13:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2013-4-25 13:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

溴酚蓝弥散问题确实不是个很大的问题。。。
你检测的蛋白是什么？它会不会本来就有两种形式？比如LC3，它本来就有两条带，很像你这种情况。

loading buffer也是买的商品化的，原来使用的是碧云天的，弥散比这个厉害，现在使用的是Bio-Rad的buffer，虽说这个溴酚蓝的弥散，可能对蛋白没有特别大的影响，可是最近内参一直曝光都是两条带，比较揪心

谢谢你的建议，谢谢

babybabe[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72893
精华 1
积分 275
帖子 226
信誉分 102
可用分 1936
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2013-4-25 13:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

真不好意思，我很菜鸟的，GAPDH都被我做成这个样子，两个条带，同学们见笑了

xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2013-4-25 14:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没关系，我一开始actin也做出过两条带，后来重新配了一抗，新提了蛋白，就好了。