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标题:【求助】p-mTOR WB求助

leifengta[使用道具]
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发表于 2013-4-26 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】p-mTOR WB求助


请教：
1、p-mTOR WB太大了，高达289Kd，该选择多大浓度的分离胶和浓缩胶合适？还是用梯度胶？另外电泳和转膜的电流、时间设定该怎么定？
2、有没有这么大的marker可供选择呢？我能找到的预染marker才250KD，CST protoco推荐用的marker才175KD，这靠谱么？
3、b-actin的内参能够在一张胶上跑么？害怕内参会很容易跑出胶去。。。另外，转膜是不是要分开？

谢谢！
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天蝎座[使用道具]
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发表于 2013-4-26 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 leifengta 于 2013-4-26 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：
1、p-mTOR WB太大了，高达289Kd，该选择多大浓度的分离胶和浓缩胶合适？还是用梯度胶？另外电泳和转膜的电流、时间设定该怎么定？
2、有没有这么大的marker可供选择呢？我能找到的预染marker才250KD，CST protoco推荐用的mar ...

1、 参考他人工作： cuturl('http://repositories.lib.utexas.edu/bitstream/handle/2152/ETD-UT-2010-12-2168/STEGALL-DISSERTATION.pdf?sequence=1')

2、高分子量预染标准： google 搜索 high molecular weight prestain ladder

3, beta-actin 不适合在一起，除非用梯度胶。


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2013-4-26 13:12
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bluelake[使用道具]
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发表于 2013-4-26 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前一段时间刚做过，p-mTOR分子量确实很大，但我用10%的胶，普通的marker，也做出来了，
电泳的时间长一点，争取让110kd的marker往下跑跑，因为我只要这个指标，所以把100kd上面的膜直接裁掉就好了。
转膜用的Bio-Rad的设备，110v恒压，5个小时。内参也在，没问题的。

当然你也可以用浓度更低的胶，这样拉的更开，但是那样40kd左右的很难保留下来。
至于marker，彩虹marker听过没？就是做这种大分子量的。
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leifengta[使用道具]
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发表于 2013-4-26 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bluelake 于 2013-4-26 13:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前一段时间刚做过，p-mTOR分子量确实很大，但我用10%的胶，普通的marker，也做出来了，
电泳的时间长一点，争取让110kd的marker往下跑跑，因为我只要这个指标，所以把100kd上面的膜直接裁掉就好了。
转膜用的Bio-Rad的设备，110v恒压，5 ...

感谢感谢！
我也是担心太稀的胶，跑胶时间控制不好连内参都出去了。。。朋友用的10%的胶能否告知跑胶的电流控制和时间呢？
依照你的经验，有没有必要买个高分子量的marker呢？我找到一个300KD的。。。
期待我的实验能成功，再次谢谢你了！
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bluelake[使用道具]
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发表于 2013-4-26 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为我当时需要的大分子量只有mTOR，所以我把110kd以上的都裁下来了，
看你自己需求吧，如果你需要的指标很多，当然应该是选择大分子量的marker，不然也没有办法裁膜啊。
至于电泳，一般都是80v 30min + 120v 1h吧，只要你想要的最低分子量的marker还没有跑掉，
尽量多跑些吧，这些大分子量的蛋白在10%的胶里面跑的很慢。
我觉得转膜的时间更重要，尽量长些吧。
祝顺利！
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发表于 2013-4-26 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前一段时间刚做过，p-mTOR分子量确实很大，但我用10%的胶，普通的marker，也做出来了，
电泳的时间长一点，争取让110kd的marker往下跑跑，因为我只要这个指标，所以把100kd上面的膜直接裁掉就好了。
转膜用的Bio-Rad的设备，110v恒压，5个小时。内参也在，没问题的。

当然你也可以用浓度更低的胶，这样拉的更开，但是那样40kd左右的很难保留下来。
至于marker，彩虹marker听过没？就是做这种大分子量的。

=============================================================================================================

我也想问问，你做的条带是双条带吗，我做出来是双的，但是我看文献都是单带，还有，你转膜5个小时吗，第一次听说这么久的，中间肯定换冰袋是吧，望指点，不胜感激！
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kswl870[使用道具]
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 小中大
1、 参考他人工作： cuturl('http://repositories.lib.utexas.edu/bitstream/handle/2152/ETD-UT-2010-12-2168/STEGALL-DISSERTATION.pdf?sequence=1')



2、高分子量预染标准： google 搜索 high molecular weight prestain ladder

3, beta-actin 不适合在一起，除非用梯度胶。

==============================================================

楼主先生，您做的是双条带不，如果是哪一条是自己需要的呢？先谢谢啦！
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bluelake[使用道具]
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发表于 2013-4-26 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kswl870 于 2013-4-26 13:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、 参考他人工作： cuturl('http://repositories.lib.utexas.edu/bitstream/handle/2152/ETD-UT-2010-12-2168/STEGALL-DISSERTATION.pdf?sequence=1')



2、高分子量预染标准： google 搜索 high molecular weight prestain ladd ...

我也想问问，你做的条带是双条带吗，我做出来是双的，但是我看文献都是单带，还有，你转膜5个小时吗，第一次听说这么久的，中间肯定换冰袋是吧，望指点，不胜感激！
我的不是，我用的是cst的抗体，分别检测p-mTOR和mTOR，只有一个条带。

如果按照你说的是两个条带，那应该有一个是杂带吧，毕竟p-mTOR和mTOR是一样的，都是289kd，

我个人觉得，如果你做出来两个间距比较大的条带，在这么大的分子量的情况下，肯定有一个是杂带，

建议用一下彩虹marker，明确一下到底是哪一个条带。

至于转膜时间，我总觉得长点比短点好吧，呵呵，而且我们把转膜槽放在冰水里，中间换一次冰。

个人意见，供参考，祝顺利！
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-4-26 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我师姐做过这么大的，6%的分离胶，4%的浓缩胶，300的marker，可以的啊
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