【求助】western blot 转膜时胶上有条带，滤纸上也有条带

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标题:【求助】western blot 转膜时胶上有条带，滤纸上也有条带

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位老师，我以前转膜都是150mA半个小时（这个我也很疑惑，为什么这么短时间），后来发现滤纸和膜一样大小时，转得100min，转半个小时大部分都在胶上（原因难道是由于滤纸直接互相接触，电流比较大？但是我有个同学说，他们的滤纸和海绵差不多大，还要转120min,这我就不明白原因了）。现在的问题是我转完之后发现，marker在胶上还有的时候，滤纸上就有了，这是我的图片。那样是说明转过了，还是没转完全，我还需要怎样改正呢？还有一个问题，我的marker能出9个条带，出现最小的marker 已经比我所要检测的最小蛋白分子量要小，我一直没做出杂出这个蛋白，给公司投诉，公司建议用0.22?m 的PVDF膜做，有这个必要么？我的蛋白是27KD,用的是0.45?m 的PVDF膜.

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2013-4-27 09:33

11961646.jpg (42.31 KB)

ending[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有必要，你试试就知道了。想想也是啊，孔径小的对小分子蛋白截留肯定更好啊。millipore的网站上也有说明。

不过我们一般转个120min也没问题。

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发表于 2013-4-27 09:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实也可以把0.22的膜放在0.45膜后面，做backup

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有必要，你试试就知道了。想想也是啊，孔径小的对小分子蛋白截留肯定更好啊。millipore的网站上也有说明。

不过我们一般转个120min也没问题。

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谢谢回复，我是想marker都转上去了，是不是说明0.45?m也是行的么？因为看丁香园上说＞20KD选0.45的，＜20KD选0.22的，才买0.45的。还请问一下，我这个胶，膜，滤纸上都有marker是不是正常情况？您发生过么？

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发表于 2013-4-27 09:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该都在膜上，其他地方都没有才好。

用0.22的吧

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ending 于 2013-4-27 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

应该都在膜上，其他地方都没有才好。

用0.22的吧

嗯，那我再试试。还有一个问题想请教您。我之前做ECL发光，条带很亮，而且持续时间有十几分钟，现在做，一种蛋白很弱，另一种蛋白还是很亮，但是持续时间非常短，就一分钟，压完一张就淬灭了，请问是什么原因呢？我以为是抗体用的时间太长了，但是我昨天全换成新的了，还是这样。

ending[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试试非超敏的ECL?

yychen[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

就是之前用挺好的，现在淬灭特别快，是我的ECL试剂出问题了？放置时间过长？有一个月多一点时间

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 27kd的蛋白、0.45um的NC膜或者PVDF膜都是没有问题的。10%的胶浓度就行。
2. 滤纸和膜的大小一样且相互接触时、滤纸间就直接变成通路类似短路这种情况、这种条件下部分电流是对转膜无用的、所以转膜时间会延长、且转膜效率降低。
3. PVDF膜截留蛋白的能力是比较强的、你看到的marke过滤纸而胶上残留marker的情况是存在的、透过PVDF膜的是预染marker的小分子、直白点说就是marker上的颜色透过去了、marker是标准大小的蛋白被染上颜色、你看到的是透过的颜色不是蛋白过去了、所以会有穿膜的假象出现。

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2013-4-27 09:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-4-27 09:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1. 27kd的蛋白、0.45um的NC膜或者PVDF膜都是没有问题的。10%的胶浓度就行。
2. 滤纸和膜的大小一样且相互接触时、滤纸间就直接变成通路类似短路这种情况、这种条件下部分电流是对转膜无用的、所以转膜时间会延长、 ...

您好，您的回答挺有道理的。照您的说法，滤纸是应该要比胶大一些的，但是如果这样，我们转膜只需30min（150mA）,与别人的2h差别太大，这是什么原因造成的呢？

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