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标题:【求助】WB实验，大分子量蛋白的内参、MARKER、...

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发表于 2013-4-27 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB实验，大分子量蛋白的内参、MARKER、...

请教各位蛋白版高手，我最近准备做一个分子量为600多KD的大蛋白的WB实验，因该分子较大，内参选择、MARKER、转膜条件出现疑问。

因为平时大家常用的主要为B-actin，B-tubulin及GAPDH，但以上这3种分子量都不大，都在30－50KD左右，且我的待测蛋白可以和actin相互作用而不能选用actin。byd123版曾说过选择以上3种可能出现内参蛋白跑出去了而我的目的蛋白还没跑出来。所以请教大家，对于600多KD的大蛋白，B-tubulin及GAPDH能否选用？如可以选用，WB实验需要注意什么问题，可能出现哪些难处理的情况？如不可选用，应选用何种内参合适？另外，我的一抗为多克隆抗体，内参选择是选择单抗好还是多抗好？与一抗为多抗有没有关系和影响？

问题较多，请了解或做过大蛋白检测的高手给予指点，十分感谢各位的帮助！！！

marker的选择和转膜条件又是如何？请有大分子蛋白western经验的高手指教！谢谢！
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发表于 2013-4-27 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过3000KD titin，700KD nebulin以及427KD的dystrophin
titin用3%~10%梯度胶，beta-actin做内参
700KD及427KD，用8%胶
电泳槽采用六一 DYCZ-24E
我认为其他两种内参都可以选择
拟做的是骨架蛋白吧
有兴趣可以继续交流
我有详细的实验方法
包括蛋白的提取
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发表于 2013-4-27 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参用santa cruz的鼠单抗都不错
我一直在用
我们公司的兔多抗，b-actin做人细胞组织的也不错
供你参考
santa cruz的一抗我有详细的稀释比例及预实验稀释度的摸索
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发表于 2013-4-27 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
santa cruz的一抗好像蛮贵的，我买的目的蛋白的一抗便是santa cruz的，2000多，不知兄台买的是不是actin做内参，我做的是骨架蛋白，可以和微丝actin和微管结合和相互作用的，考虑actin和tubulin做内参可能都会影响结果，但国外权威cell文献都是用tubulin，故我也打算选择tubulin来做内参，兄台买的santa cruz的一抗花费多少？如你用的actin，是否与tubulin的详细稀释比例和预试验稀释度都会有所不同？
另外，大分子蛋白在梯度胶等选择配制上是否有讲究？听我们科一实验高手称如此大蛋白WB做起来恐怕难度比较大。不知可否多点分享兄台的成熟经验？
与兄台都是做骨架蛋白方面实验，也算有缘。可否分享兄台关于大分子骨架蛋白详细的实验方法，包括蛋白的提取。非常感谢！
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发表于 2013-4-27 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
兄台用多大电流转膜?比如做700KDnebulin时？
我知道一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h，但大分子量的蛋白就不清楚了。
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发表于 2013-4-27 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

santa 的一抗都在2800左右
GAPDH，beta-tubulin，beta-actin内参我都有
有兴趣可以匀一些给你
以前做nebulin与titin时只有beta-actin
所以就用它做内参
现在这三种内参都有了
不同的抗体稀释比例都不同
在相同的组织中用不同的提取方法做出来的效果都不一样
nebulin转膜条件：25mM tris，192mM glycine，0.1% SDS，20% methanol
湿转
300mA，2h30min左右
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发表于 2013-4-27 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
nebulin胶浓度是7.5%
等我下班后看了记录再告诉你一些详细信息
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发表于 2013-4-27 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用marker用的是那种？咱俩做的蛋白分子量都是超大，而一般marker最大值也就200多KD，如何选择合适的marker？用最大值200多的好像不好说明问题吧？
一开始打算做时信心满满的，现在听了好几个人都说这么大蛋白很难做WB，跑胶和转膜时可能出现困难，不知兄台在做的过程中是否遇到过此类问题？如何解决？今天一个专帮人做WB的公司本来还兴致勃勃的向我推销他们做得多好多好，结果一听我的分子量，都不敢接我的单了！说难度较大，有可能做不出来，真晕，对于我这个WB新手来说，年前想做完WB预试验确定该蛋白有没有意义看来难度很大啊！等我国外一抗过来可以开始可能离过年也就10多天了！着急啊！
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发表于 2013-4-27 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是打击你，难度太大了。
解决内参跑出去的问题，倒梯度胶。
转膜最好转过夜。
抗体没你想像的那么夸张，只要特异性够，随便都可以的。
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发表于 2013-4-27 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Marker就只有那么大了
你有多少样？
需要做多少张膜？
每张膜8个样
我可以接你的活
你只需要提供你的目的蛋白的抗体
内参与二抗我可以提供（不过内参的一抗要单独收取费用）
我就是用梯度胶做的
另外你要告诉我具体蛋白名称
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