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标题:【求助】有用过Pierce膜蛋白提取试剂盒的群友请进

superboy[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有用过Pierce膜蛋白提取试剂盒的群友请进


小弟现在做一个膜蛋白的vwestern，分子量为50多，之前用RIPA的裂解液，还可以看到目的条带，但是很淡，为了更好的效果，小弟又专门订了Pierce膜蛋白提取试剂盒，结果很奇怪的就是按照它的提供的步骤，在最后一步时我始终看不到疏水相（目的蛋白所在层）与亲水相的分层，无法提取出目的蛋白，有用过Pierce膜蛋白提取试剂盒的战友请进来指点下什么原因，纠集中！万分感谢！！！
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yonger[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没用过，不是说现在默克出了个提膜蛋白的试剂盒还不错，不过我也没用过，不好意思
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近也在用Pierce膜蛋白提取试剂盒，我能清楚地看到疏水相与亲水相的分层，但是疏水相中加了loading buffer煮沸后，发现二者互溶不均匀，而且液体呈粘稠状，很难上样。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也正在用Pierce的盒子提膜蛋白 其他都还好 就是觉得浓度有点低 你的疏水相不能直接加Loading,要先用他们盒子里面的试剂B稀释你的膜蛋白样品，然后才能上样，具体步骤：先将试剂B稀释4倍（用双蒸水），然后用稀释的B去稀释你的疏水相样品（稀释2到5倍），最后才加Loading。
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yonger[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位战友好！我是提膜蛋白的新手。最近用Pierce的膜蛋白提取试剂盒，发现疏水相与亲水相是有分层，而且疏水相和亲水相体积差不多，得到的体积还是很大的，这样蛋白浓度不是很低吗？如果上样时再用bufferB稀释，岂不浓度更低？组织里提的膜蛋白加了loading buffer后，也是要煮沸才上样吗？有些说膜蛋白可以不用煮沸就上样。我昨天拿去跑SDS-PAGE,发现什么带也看不到，我是直接加loading上样，没有稀释，也没有煮沸，是因为这个原因还是蛋白浓度太低？
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用Pierce的 M-PER®Mammalian Protein Extraction Reagent 盒子提总蛋白，按照说明书离心完了之后没看见细胞碎片什么的沉淀，也没见到疏水层和亲水层的分层~液体也不粘稠~用碧云天BCA蛋白测定试剂盒检测，有蛋白存在，请问这样测出来的蛋白准确吗？园里有人用过这个试剂盒吗？ 恳请指教，谢谢~
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Do not exceed 10 samples in one extraction procedure because rapid resolubilization of the hydrophobic phase into the
hydrophilic phase occurs at room temperature.
这是试剂盒里的一句话
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bs4665[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们都很严格的按照说明书操作：用的是25ml的培养瓶来提蛋白，先用PBS冲洗2遍，然后用400UL的提取液，轻摇5MIN，然后吸取提取液，14000转5分种没分层，转10分钟也没分层。。。到底怎么回事呢？
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superboy[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Do not exceed 10 samples in one extraction procedure because rapid resolubilization of the hydrophobic phase into the
hydrophilic phase occurs at room temperature.
这是试剂盒里的一句话

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难道是要加入提取液5分钟之后，马上移入离心管，马上离心吗？
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lgm[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
难道是要加入提取液5分钟之后，马上移入离心管，马上离心吗？

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这句话可能是指你在离心后如果没有及时将疏水层吸出，2者还会混起来。
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