蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】我要做血清或血浆的westernblot该怎么处理标本?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】我要做血清或血浆的westernblot该怎么处理标本?

whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态 离线
1
 

【求助】我要做血清或血浆的westernblot该怎么处理标本?

求助各位高手,我要做血清或血浆的western blot,我的标本该怎么处理?是不是只要灭活就可以?我要测的蛋白分子量为72kd,我是新手求各位高手帮忙!谢谢!
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
2
 

不需要特别的处理,

将血浆或血清用PBS适当稀释上样即可。另外就是要注意防止蛋白降解

此外需要了解该蛋白在血浆中的丰度问题,以方便选择适当的上样质量,(最好能在预实验的时候做几个上样量的梯度进行观察)

还有一个需要注意的问题就是 loading control的选择,由于血浆或血清中很难找到一个稳定表达的蛋白,常见的在组织中比较常用的内参蛋白如肌动蛋白,GAPDH等,严格讲并不适合血浆或血清,故loading control需要认真考虑
可以考虑用立春红染色 或考染做loading control(这种方法在不少文献中都有报道,是大家认可的)
顶部
sunnyB[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77335
精华 0
积分 581
帖子 862
信誉分 100
可用分 5059
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
3
 


QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-4-27 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不需要特别的处理,

将血浆或血清用PBS适当稀释上样即可。另外就是要注意防止蛋白降解

此外需要了解该蛋白在血浆中的丰度问题,以方便选择适当的上样质量,(最好能在预实验的时候做几个上样量的梯度进行观察)

还有一个 ...

用丽春红或考染可以做loading control吗?可以给出文献链接吗?
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
4
 


QUOTE:
原帖由 sunnyB 于 2013-4-27 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


用丽春红或考染可以做loading control吗?可以给出文献链接吗?

你在google学术搜索里面搜索一下就可以发现很多文献就是用的这种染色方法做loading control,包括高水平的杂志都是认可的。

另外还有一个好处就是可以评价转膜效果。说不定就有可能刚好你的目的蛋白区域的转膜效果就存在异常了

这样还省了买内参抗体的钱。

这个是关于立春红的的链接,考染可以用同样的方式搜索

cuturl('http://scholar.google.com.hk/scholar?hl=zh-CN&q=%E2%80%9Cloading+control%E2%80%9Dwestern+Ponceau&btnG=%E6%90%9C%E7%B4%A2&lr=&as_ylo=&as_vis=0')

举个例子 这个是Blood上的文章 用的是立春红染色做control

cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16081696')


查看积分策略说明
附件
2013-4-27 16:34
64774375.png (30.57 KB)
 
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
5
 

丽春红染色可以做control?
顶部
sunnyB[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77335
精华 0
积分 581
帖子 862
信誉分 100
可用分 5059
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
6
 


QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-4-27 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


你在google学术搜索里面搜索一下就可以发现很多文献就是用的这种染色方法做loading control,包括高水平的杂志都是认可的。

另外还有一个好处就是可以评价转膜效果。说不定就有可能刚好你的目的蛋白区域的转膜效果 ...


立春红只是作为一种染色剂吧。我看了你的NCBI那篇文献 cuturl('http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/106/12/3979')
请看我的截图,这里面好像是beta-actin为所用loading control


查看积分策略说明
附件
2013-4-27 16:35
23868203.snap.jpg (41.45 KB)
 
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
7
 
或许我列举的这篇blood上的文献不是最恰当的离子,或许该文在不同的样品有不同的选择或者是两种方法的结合。另外我的截图所示的内容应该也是正确的,也说明了作者用到了染色这种方式做control。

另外你可以看看搜索链接中的其他文献(当然只是其中的一部分,非全部)。总之,我认为这种方法 肯定是可行的,并是得到认可的。

在列举个例子吧,是nature上的一篇lettter:The ADP/ATP translocator is not
essential for the mitochondrial permeability transition pore(截图见下)

另外我也咨询过abcam公司香港分公司的技术支持,他的意见也表明这种染色的方式是可选的。【见截图】

此外,我觉得还需要注意的是,对于目前常用的以一些管家蛋白如GAPDH,actin等,虽然在WB实验中在广泛使用,但并不代表他们就是没有缺陷的,近年来不少资料都显示这些管家蛋白并不一定是“假想的恒定表达”,还是有受到到质疑的地方。 也就是说,这些control的方式都不完美,还需要做不少的工作找到一个合适的control

故而,这些方式,不管是管家蛋白,还是立春红或考马斯亮蓝染色等 都是可选的。

实际上染色的方式,还节省了买抗体的钱,对于不少实验室来说,还是很值得的。

β-Actin is not a reliable loading control in Western blot analysis Electrophoresis 2006, 27, 2844–2845

下面两篇文献都说明立春红或考然是可以用作loading control的,可以看看【同时其中JPR的文献也说明GAPDH做内参也有局限性】
Analytical Biochemistry 401 (2010) 318–320
J. Proteome Res DOI: 10.1021/pr1011476


查看积分策略说明
附件
2013-4-27 16:36
14651388.snap.jpg (50.4 KB)
 
2013-4-27 16:36
63597126.png (23.6 KB)
 
顶部
hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
8
 


QUOTE:
原帖由 am10 于 2013-4-27 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
或许我列举的这篇blood上的文献不是最恰当的离子,或许该文在不同的样品有不同的选择或者是两种方法的结合。另外我的截图所示的内容应该也是正确的,也说明了作者用到了染色这种方式做control。

另外你可以看看搜索链接 ...

近年来的确有很多研究表明,GAPDH和actin作为内参并不完全科学。据abcam的文献说道,这两个内参一般用于whole cell 和cytoplasmic的细胞类型。而对于像线粒体或者核这些细胞类型只能选择像VDCA1/porin,LaminB1等内参,作为housekeeping gene的它们有时候甚至在某些样本里并不表达,但是对丽春红作为loading control了解比较少而已,科学在不断进步,研究手段日新月异,仅此而已。
顶部
am10[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76183
精华 0
积分 676
帖子 971
信誉分 100
可用分 5735
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9
 


QUOTE:
原帖由 hustwb 于 2013-4-27 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')



近年来的确有很多研究表明,GAPDH和actin作为内参并不完全科学。据abcam的文献说道,这两个内参一般用于whole cell 和cytoplasmic的细胞类型。而对于像线粒体或者核这些细胞类型只能选择像VDCA1/porin,LaminB1等内参, ...

所以这些方式都是可选的,具体应用可能要根据实验室的习惯或条件,以及研究样品的特点等综合考虑,选择一个最适合的就可。

我也是最近要做WB,并且由于我的样品特点决定了没有一个合适的内参,才使得需要了解了一下这方面的资料。 看能否有变通的方式来做control
顶部
star#room[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76306
精华 0
积分 421
帖子 501
信誉分 100
可用分 3361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
10
 

用立春红做control,是看条带的深浅吗?不懂哎,能不能有人帮忙解释一下呀
顶部