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标题:【求助】诱导表达蛋白western鉴定不对

pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】诱导表达蛋白western鉴定不对


现构建pet28a+目的片段原核表达载体，目的片段带TAG终止密码子（重组质粒测序正确），IPTG诱导蛋白表达后理论蛋白大小约为19KD，现诱导后跑SDS-PAGE在20KD大小处出现目的蛋白！但用6*HIS tag标签抗体做western blot发现出现目的条带的确是14KD左右的蛋白！见图！这是为什么呢？将14KD蛋白切下做质谱鉴定并非所需目的蛋白！
望大侠们赐教！


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2013-4-27 16:38
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
基本可以断定20KD是目的条带，14KD也许是载体上的一段产物
20KD条带用His抗体检测不到？
直接切20KD条带上质谱，以质谱结果为准
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 zhenxin 的帖子

可是20KD处western blot检测不到！难道要换载体？
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pengke1983[使用道具]
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 小中大

回复 #2 zhenxin 的帖子

因为我后面要过镍柱纯化此蛋白！所以就算蛋白鉴定是对的，它不带His tag的话，该蛋白我也得不到啊！
是原使用的载体有问题吗？？求助！求助！
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发表于 2013-4-27 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
测序验证下翻译后是否还带有his标签，一定看好阅读框，包括his的阅读框。个人认为蛋白是表达出来了，抗体检测不到可能是由于表达的蛋白没有his标签。his标签的阅读框与蛋白的不一致。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重组载体已经测过序，阅读框也没有问题啊！his的阅读框也是对的！为什么SDS-PAGE跑出来再14KD的地方会出现含量这么高的蛋白，且空载体上也有！还带his标签？是原载体的原因？
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发表于 2013-4-27 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 pengke1983 于 2013-4-27 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

重组载体已经测过序，阅读框也没有问题啊！his的阅读框也是对的！为什么SDS-PAGE跑出来再14KD的地方会出现含量这么高的蛋白，且空载体上也有！还带his标签？是原载体的原因？ ...

哪个地方蛋白含量高应该很容易解释，因为没有诱导的也有很高的表达量。如果阅读框没有错，应该不会有这种情况阿。。。能够贴出从atg开始那部分序列？
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看似一切都很正确。。。28a+里面有两个his，难道是翻译不是从第一个m开始，是从后面某一个开始，而后面那个his在同样的阅读框里面？？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
第一个m是？引物加了终止密码子后面一个his应该不会表达啊？
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-4-27 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 pengke1983 于 2013-4-27 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第一个m是？引物加了终止密码子后面一个his应该不会表达啊？

也对，搞不明白。。。
marker位置应该没有问题吧 。。
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