小中大荧光光度计通常采用光栅来进行波长的准确定位,通过光的衍射和干涉得到明暗条纹,不同波长光的最强衍射花纹出现的位置稍有差别,从而通过光栅把一束混合光按分解成不同波长依次摆列的光带,一般而言,单位长度内,光栅条纹越多,分光效果越好,通过光栅的偏转和出射狭缝的偏移,得到不同波长的光。但是按照光的衍射定律,光在nλ都会发生衍射现象,因此300nm在600nm,900nm出也会发生衍射。
荧光光度计通常使用两组分光器,激发一个,发射一个。并且两束光通常呈90°,测定发射光谱时,激发波长固定,发射光分光器在一定波长范围内偏转得到不同波长的强度,但偏转到激发波长的整数倍时,激发光也能发生衍射现象,即与发射光混合。一般来说,激发光强度很大,而发射光强度较小,因此出现倍频峰。
液体样品的浓度比较大时,对激发光的吸收比较强,且倍频峰处的发射光强度比较大,这是测定的倍频峰不明显,其他时候都需要处理,加滤光片,或者通过数据处理把倍频峰消掉(倍频峰一般是半峰宽较窄的对称峰)。
比如400nm的滤光片应该是400nm长通的滤光片,也就是说400nm以后的光通过,400nm以前的光滤掉了,因此不会滤掉发射峰。
你用300nm激发,在600nm肯定有倍频峰,在900nm会有三倍频,这些倍频峰都可以通过滤光片滤掉。由于这些倍频峰都是因为300nm的激发光引起的,而不是实际存在这样的荧光峰,因此,只需要将300nm的激发光滤去即可消除倍频。
选用滤光片时,应该综合考虑你的激发光和发射光谱的宽度,如果你的发射光谱在400nm的地方已经有峰了,而且400nm的峰对你很重要,那就应该选择更低一点的长通滤光片。
此外,滤光片应该置于发射窗口之前,样品池之后。