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标题:【求助】糖蛋白纯化

lxh031[使用道具]
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发表于 2013-5-2 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】糖蛋白纯化


大家好！我想问下，我最近在做人腹水纯化，目的是得到CA抗原，此抗原是糖蛋白，分子量在200-2000KD，咱们有用亲和层析纯化，用针对于CA抗原的抗体接柱，通过抗体与抗原特异性结合，最终把抗原纯化出来，但纯化后收集的样品活性弱或者纯化前后活性差异大，4%浓缩胶+6%分离胶电泳结果：目的蛋白无法呈现出来，目前测浓度是无法定性与定量的，我只能通过ELISA检测才能知道有目的蛋白的存在，我现在想通过电泳的结果直观快速的知道目的带型存在，纯度如何，量有多少？希望你们可以帮忙提供下跑电泳方案。谢谢……
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发表于 2013-5-2 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

糖蛋白用考染的方式是不行或不好的
另外你的蛋白分子量可能特别大，那么电泳效果肯定不好
你纯化的前后活性差异大，理论上说你用亲和层析应该活性富集了才对，但效果不好
是不是亲和层析解离条件对糖蛋白有影响，你可以验证一下，如果真有影响你可能要采用其他的纯化方式
你考虑电泳后，用银染试试(意图是把蛋白中糖氧化成醛基，再发生银镜反应)
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发表于 2013-5-2 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以考虑用凝集素或硼酸做配基的亲和填料纯化糖蛋白试试。
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发表于 2013-5-2 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这么高分子量的糖蛋白几乎不能用SDS-PAGE检测，即使有条带也是弥散的，还要进行烷基化处理，建议HPLC分析纯度和分子量
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-5-2 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们采用刀豆蛋白进行实验，纯化出来的目的糖蛋白量非常少。麻烦你把硼酸做配基的操作流程发给我。
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发表于 2013-5-2 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lxh031 于 2013-5-2 13:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们采用刀豆蛋白进行实验，纯化出来的目的糖蛋白量非常少。麻烦你把硼酸做配基的操作流程发给我。

我感觉你必须先确定你的蛋白是否结合在ConA的层析柱上还是挂上柱子后，洗下来没有活性
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tudou85[使用道具]
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发表于 2013-5-2 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 KGZ564 于 2013-5-2 13:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可以考虑用凝集素或硼酸做配基的亲和填料纯化糖蛋白试试。


您好：我想用sepharose 6B制备b-lactose sepharose 6B柱然后偶联凝集素 用来检测糖蛋白。但不知道制备sepharose 6B是否需要相应的纯化仪器或设备？实验室没有过这方面实验基础，请您多多指教！谢谢！
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-5-2 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这么高分子量的糖蛋白几乎不能用SDS-PAGE检测，即使有条带也是弥散的，还要进行烷基化处理，建议HPLC分析纯度和分子量

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嗯，跑出来的带型太弥散，无法确定样品纯度。我们公司没有HPLC设备。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-5-2 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我感觉你必须先确定你的蛋白是否结合在ConA的层析柱上还是挂上柱子后，洗下来没有活性

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当时做实验的情况是此蛋白与ConA结合效果不好，挂上柱的蛋白量少，洗脱下来的样品有活性，但较低。
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lxh031[使用道具]
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 小中大
糖蛋白用考染的方式是不行或不好的
另外你的蛋白分子量可能特别大，那么电泳效果肯定不好
你纯化的前后活性差异大，理论上说你用亲和层析应该活性富集了才对，但效果不好
是不是亲和层析解离条件对糖蛋白有影响，你可以验证一下，如果真有影响你可能要采用其他的纯化方式
你考虑电泳后，用银染试试(意图是把蛋白中糖氧化成醛基，再发生银镜反应)

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我们买了个糖蛋白染色试剂盒进行实验，但结果不理想，想尝试你说的银染方法，麻烦把详细的实验方法发给我下。
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