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标题:【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

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发表于 2013-5-2 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

我做过不少磷酸化蛋白的Western blot，之前在免疫学技术讨论版发过贴子：

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=11443307&sty=1&tpg=1&age=0')

根据蛋白版fangweibin119版主的建议，我在这里新开贴子，与同仁们交流。

如有同仁对磷酸化蛋白的Western blotting有问题，可在此跟贴交流。
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发表于 2013-5-2 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近提取血液中的netrophils，做Western blot，发现有些二抗会干扰到最后的条带。比如，二抗anti-mouse会有很多杂带，在42KD也有一条与actin重叠，如果您在做人体的白血球时，如果选择的normalized control为二抗是anti-mouse的actin，那么就要小心了！最好您可以选择二抗是anti-rabbit的GAPDH。但是我目前还没有发现体外培养的细胞株有如此现象。
提醒大家一下。
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2013-5-2 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想做，但是还没做，
问个基础问题啊，一个抗体为啥能识别磷酸化和没有磷酸化的蛋白质呢？
如果我想自己做磷酸化的抗体，是否可以合成一段12个氨基酸左右的肽其中带有磷酸化的Ser，这样成功的几率怎么样？
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发表于 2013-5-2 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 dongdongqiang 的帖子

那要取决于您设计的多肽作为Immunogen的特异性如何了。如果氨基酸序列中带有磷酸化的Ser且特异性较好的，成功的几率就高一些。当然，生物体内比较复杂，所以提取抗体后还要做特异性和亲和性等方面的检测。
至于一个抗体为啥能识别磷酸化和没有磷酸化的蛋白质，那是因为抗体具有高度特异性，甚至可以分辨一个氨基酸的差别，区分其蛋白质特定氨基酸有无磷酸化。
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发表于 2013-5-2 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看了楼主在免疫版的全部帖子，大有收获，非常感谢楼主
本人在做p-mTOR及mTOR的WB有2个月了，beta-actin已经做得挺满意了，但是目的蛋白一直没有做出来，原来以为做出来了后来发现是非特异性条带，郁闷极了。想请楼主指点迷津啊！
细胞裂解液是自己配置的，添加了PMSF及ROCHE的COCKTAIL
使用6%Sep GEL, 80V,100V 电泳
PVDF膜转膜，300V，3h
5%牛奶封闭 1h
一抗（用5%牛奶配置，没有完全按照说明书）overnight
二抗 1h
odyssey 看结果

看了楼主的帖子后，我发现问题会不会在于没有使用磷酸酶抑制剂，及一抗的配置呢？
楼主帮帮忙啊，我都快不敢见老板了，郁闷
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831226[使用道具]
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发表于 2013-5-2 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个问题想摆脱楼主
如果提取蛋白后立即进行电泳，能否不加磷酸酶抑制剂呢？
还有就是做磷酸化蛋白是不是用ECL会比较好呢？

再三感谢楼主了
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发表于 2013-5-2 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 831226 于 2013-5-2 17:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有一个问题想摆脱楼主
如果提取蛋白后立即进行电泳，能否不加磷酸酶抑制剂呢？
还有就是做磷酸化蛋白是不是用ECL会比较好呢？

再三感谢楼主了 ...

回答：
1，没有使用磷酸酶抑制剂会影响结果，尤其是一些初学者因为不太注意细节，影响更大。
2，一抗的配置最好参考厂商建议。
3，为了排除您个人操作的失误，建议您先用阳性对照试一下，以保证您是可以做出实验的。也有可能您对细胞的处理本身不会造成mTOR磷酸化。
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发表于 2013-5-2 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 831226 于 2013-5-2 17:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有一个问题想摆脱楼主
如果提取蛋白后立即进行电泳，能否不加磷酸酶抑制剂呢？
还有就是做磷酸化蛋白是不是用ECL会比较好呢？

再三感谢楼主了 ...

回答：
1，即使马上电泳，也要加磷酸酶抑制剂。
2，用ECL做出的条带漂亮一些，但不会影响结果太多。
3，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一个细胞株，然后选相同的厂商的抗体。
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发表于 2013-5-2 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想用WB测定大鼠脊髓中nNOS（神经型一氧化氮合酶）四个位点的磷酸化水平，不知需要注意哪些问题，抗体选择有什么窍门呢？谢谢
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发表于 2013-5-2 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 XYZQ 于 2013-5-2 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想用WB测定大鼠脊髓中nNOS（神经型一氧化氮合酶）四个位点的磷酸化水平，不知需要注意哪些问题，抗体选择有什么窍门呢？谢谢

您如果是初次做，建议如下：
1，操作尽量低温。
2，细胞裂解液中要加磷酸酶抑制剂。
3，最重要的一点，我在前面已提过，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一个细胞株，然后选相同的厂商的抗体。
4，一抗尽量选择多克隆抗体。如果厂商能提供阳性对照则更好。
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