【求助】奇怪的AKTA-FPLC堵柱子问题

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标题:【求助】奇怪的AKTA-FPLC堵柱子问题

niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-5-7 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

近期我们实验室的AKTA-FPLC superdex200 柱子频繁压力增高。但压力增高的方式比较奇怪。在上样后压力一般不高，直到蛋白快流出来的时候（有紫外吸收为证）压力才升高，而且很难再降下来，一般需要NaOH倒冲才可以将压力降至正常。这种情况频繁出现，搞得我们很头大，希望高手指导。

有人认为是柱子下面的膜堵塞，但我认为柱子下面的膜是为了挡住beads不漏出的，孔径应该很大，至少不比柱子上面的膜小，为什么蛋白在进柱子的时候不堵，在出柱子的时候堵？

下面附图一张，流速为0.5ml/min,蛋白为复性后的多聚体，复兴效果不好。压力从0.5mPa增至0.65mPa，此后一直缓慢增高至0.9mPa，只能再反冲。反冲压力为0.45mPa。

附件

2013-5-7 15:30

48529578.jpg (35.97 KB)

DNA[使用道具]
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发表于 2013-5-7 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的蛋白质样品不稳定，在洗脱过程中有沉淀析出，注意观察10ml后紫外就一直没下来，估计已经形成的蛋白质沉淀在不断溶解并洗脱出造成的严重拖尾。建议换个其它的蛋白质样品用同样的条件过一次，可以得到一定提示。

niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-5-7 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是凝胶过滤，流动相是不变的，在上样前已做过实验，蛋白样品可以与流动相互溶。至于拖尾，很有可能蛋白的降解。作别的蛋白样品也出现过类似问题。现在基本上是这种情况：每过一个样品就需要反冲，NaOH洗，再用流动相长时间冲洗才能稳定到满意的状态。

DNA[使用道具]
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发表于 2013-5-7 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上样前互溶并不代表在洗脱过程中你的蛋白也一直保持稳定，凝胶柱如此温和的洗脱条件你的样品都有降解，说明你的样品极不稳定，在柱上产生沉淀非常有可能。但你说其它蛋白也有类似情况发生，那么可以考虑应该是柱子非常不干净。1M NaOH未必洗得非常彻底，我曾经也遇到过也是压力起来了，只用NaOH洗，压力当时是下去了，但只要再上几次样压力又会起来，后来用1M NaOH和0.1M HCl交替洗上1～2CV，2个循环后，就好多了，后来压力一直维持正常，可以试试。但结合你的图来看还是高度怀疑是你的样品问题。建议还是先彻底清晰柱子再看看效果吧。

niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-5-7 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚才用2M尿素洗了，又用0.5MNaOH洗了……没用。还很坚挺。

可是，可是我现在还不想用1M NaOH和0.1M HCl交替洗啊，说明书上说的用量可比这个小多了，搞不好挨老师批呢。唉。

tianmei001[使用道具]
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