小中大我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。
注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。
2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。
附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。
最后附上我的图片：
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真的服了lee800265，我做260的核蛋白，怎么做都不出这种结果，我染过胶，发现250以年蛋白条带就少的可怜，我是湿转，低压过夜跟恒流300ma三小时都试过了，膜上有泳道，不出目的蛋白条带。。。。郁闷中！
