【求助】PVDF膜如何做点杂交

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标题:【求助】PVDF膜如何做点杂交

popo520[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做western，总是不出结果。看了论坛不少帖子提到了蛋白质点杂交，也想试一试，看看目的蛋白表不表达目的蛋白。但有几点不明白，步骤中提到了把膜烘干，包括加样前和加样之后烘干，有室温晾干10min，也有放烤箱的。但是之前一直听实验室的师兄说膜千万不能干。我用的是PVDF膜，晾干会不会影响结果呢？膜要怎么处理？关于样品。有的说是不用煮沸和加loading buffer 直接点在膜上就可以了。有的说要。样品该如何处理？急盼有做过的大侠指点一二！

DONT[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看看哈佛的方法吧：
cuturl('http://labs.idi.harvard.edu/springer/uploads/Protocols/DOTBLOT.pdf')

popo520[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

protocol 用的都是 NC膜。PVDF膜不行吗？

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 western 蛋白是通过加热煮沸和loading buffer 中SDS变性的，当你试图通过点杂交来摸索条件或看看是否有目的蛋白时也应该向 western一样处理。
2 膜是这样的当你点上样品后要烘干，目的是使蛋白固定在膜上，在随后的过程中，加一抗以后就不能干了，否则非特异性会非常高

3顺便说一下，pvdf膜与nc膜各有优劣，都能用，但选择时要根据目的蛋白的大小来选。（膜孔径）

gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目的蛋白表不表达目的蛋白,SDS-PAGE 就可以看得出来。
还有免疫印迹不出结果主要看你表达出的是可溶性蛋白？还是包涵体蛋白？再就是一抗是否效价高或纯都有关系。

popo520[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

按照4楼朋友的说法pvdf膜与nc膜都可以。怎么2楼朋友给出的哈佛的protocol里面还强调了 (NOT PVDF!) 还用感叹号，是不是不能用PVDF膜只能用NC膜?新生小白。望大家赐教！

mysmdbl[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

NC膜是亲水的，PVDF膜是疏水的。
2楼提供的方法是将蛋白溶液直接点在膜上并干燥。NC膜可以用这种方法固定蛋白，而PVDF膜由于不亲水，蛋白水溶液是固定不上的，你自己可以试试，非常明显。
当然，如果用电转将蛋白转到PVDF膜上就没什么问题了。

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

点膜我这边玩过很多次， PVDF，PSQ和NC膜都是可以的。只不过前两个用之前都要用甲醇泡一泡活化一下，泡后马上转到PBS中，准备好样品，再把膜从PBS里提出来放在湿滤纸上，沥干膜表面的水，就可以点蛋白了，点一点上去，等它干得差不多了可以再点一点，全部点完后，晾干，烘干，烤干都可以。干后再你用常用的方法封闭，后面的过程注意不要干了，干了就容易产生很重的背景。至于NC膜就不用这麻烦了，拿起来就直接点样，点完后的过程和前面一样了。

fsdd817[使用道具]
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发表于 2013-5-8 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做过一次点杂交，就是用的PVDF膜，用之前活化，点蛋白时候小心，点一点，晾干，再点。点尽量小。然后接着WB做就行了。