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标题:【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

蒜泥面条[使用道具]
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【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

在学校做了2年,在一家抗体公司做了5年多的抗体和抗原纯化,经过我的手或者下面员工的手,纯化过的抗体不下几千个了,如果以重量计估计要以斤算……

单抗,多抗

IgG IgM IgY

上清 血清 腹水 蛋黄

疏水 抗原免疫亲和 嗜硫 proteinA proteinG 硫酸铵沉淀 辛酸萃取

……
都做过一些

在抗体纯化或者抗体相关技术方面有需要帮助的战友们(也时常有战友私下发短消息给我,不如发出来,大家一起讨论),欢迎发帖来讨论,大家互相学习,共同提高
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NBA[使用道具]
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我最近也在做抗体纯化,正苦于没人问。看来楼主是抗体纯化的高手啊,以后要多请教了。

先问个问题,从血清纯化IgG,需要经过哪些纯化步骤?我现在是用辛酸-硫酸铵沉淀,然后过DEAE-纤维素阴离子交换柱,感觉效果不太好。
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QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-5-8 15:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我最近也在做抗体纯化,正苦于没人问。看来楼主是抗体纯化的高手啊,以后要多请教了。

先问个问题,从血清纯化IgG,需要经过哪些纯化步骤?我现在是用辛酸-硫酸铵沉淀,然后过DEAE-纤维素阴离子交换柱,感觉效果不太好。 ...

高手不敢当啊,就是纯化过不少抗体而已
纯化抗血清,如果有纯抗原(0.5mg以上)都推荐做抗原免疫亲和纯化,其次是proteinA的亲和纯化。再其次是用硫酸铵分级沉淀。
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wood533[使用道具]
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本来我很有些反对那个年终排名的,没想到能把楼主引出来开这个帖子,有幸!

关于抗体纯化,看起来很简单,protocol一堆一堆的,当然,如果只是纯化一点少量抗体做试验室的试验用,抗体纯化很简单。

但实际上做过几十个或上百个以上抗体纯化的老手就会知道,抗体纯化不简单!甚至比那些大肠杆菌表达的重组蛋白要难。做商品化应用的抗体纯化同行们也有此体会吧?
难有几个方面。

例如原料的差异。无论是单抗腹水还是多抗血清,不能保证每批原料的相同,有时候甚至差异很大。当一批纯化抗体出现问题时,是原料原因引起还是纯化过程引起的排查就很有得受。而重组的E.Coli.或酵母蛋白相对要均一性的多。

例如抗体活性的保持。对重组E.Coli.或酵母蛋白,如果是可溶蛋白,其活性往往较稳定,只要不降解,变化不大。而抗体却表现的很微妙。缓冲液、温度或纯化用柱的细微变化往往会带来差异较大的结果。

非常高兴楼主开这个帖子。我先来问一个问题。
在单抗腹水前处理过程中,由于免疫方式的不同,有些腹水往往含有较多的石蜡油,造成过滤困难,而且会堵纯化的在线过滤器和柱头,也会粘附在纯化胶上,如何通过前处理过程去除呢?希望对抗体的损失不大。
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QUOTE:
原帖由 wood533 于 2013-5-8 15:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

本来我很有些反对那个年终排名的,没想到能把楼主引出来开这个帖子,有幸!

关于抗体纯化,看起来很简单,protocol一堆一堆的,当然,如果只是纯化一点少量抗体做试验室的试验用,抗体纯化很简单。

但实际上做过几十个或上百个以 ...


说的很专业

很多实验技术,都是看起来原理简单,方法常规,但是真正做起来就会发现这样那样的问题和情况,你遇到过,就会知道实际情况比理论要复杂,这个就是所谓的经验了。

腹水里面和血清里面,有时经常有油脂类或者SKYKILLER提到的石蜡油,很讨厌,我们也经常遇到。

我们一般是使用稀释液把样品稀释,然后高速离心,然后小心拿出来,油脂类的会浮在液面上,然后就用棉签之类的挑去。样品稍微会有些损失,但是因为稀释过了,单位体积里的抗体损失比原液就少很多。

不知道还有没有什么更好的方法:p
期待路过的大侠们多发表意见
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wood533[使用道具]
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多谢楼主回答我的问题。再问一下楼主,纯化抗体需要哪些仪器和材料?可以从哪里购买?我现在手头基本上一无所有。刚才上GE的网站,找到他们北京办事处的电话,想问问他们的层析柱,居然全是空号。
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原帖由 wood533 于 2013-5-8 15:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
多谢楼主回答我的问题。再问一下楼主,纯化抗体需要哪些仪器和材料?可以从哪里购买?我现在手头基本上一无所有。刚才上GE的网站,找到他们北京办事处的电话,想问问他们的层析柱,居然全是空号。 ...

对于小量纯化而言,其实对设备的要求是很低的。尤其是亲和色谱

关键在技术和填料,填料有进口国产之分(技术不分国产和进口哈)

因为工作的便利,个人几乎用过抗体纯化领域所有进口知名厂家的填料和国产某些厂家的填料。
感觉GE的填料整体上是业界最好的,但是单项来看不一定是最出色的。
不少厂家都有拿手的填料,有些国产的产品也是不错的。

人家嫩生存必有其道理所在,虽然GE(或者叫amersham亦或Pharmacia)在生物纯化这个领域还是一家独大。

还有一个建议,不一定要买最贵的填料,适合自己,能满足自己需要的,价格最便宜的,就是好填料!

实验室设备主要需要有离心机 分光光度计 注射器 空柱子 填料 连接管线等等

不过个人的意见:如果像你这种以前也没做过,也没设备,不需要建立纯化平台,又不需要靠纯化抗体来发文的,其实我更建议你找个外面的公司外包算了,免疫亲和纯化一个抗体也就是1,2千块的事情,这样比一穷二白,自力更生建立这个体系方便实惠
的多
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wood533[使用道具]
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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-8 15:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


对于小量纯化而言,其实对设备的要求是很低的。尤其是亲和色谱

关键在技术和填料,填料有进口国产之分(技术不分国产和进口哈)

因为工作的便利,个人几乎用过抗体纯化领域所有进口知名厂家的填料和国产某些厂家的填料。
...

我是在公司做生产,正是想建立纯化平台的,又不知道如何下手。楼主有GE的销售或客服部门的电话吗?
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蒜泥面条[使用道具]
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原帖由 wood533 于 2013-5-8 15:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我是在公司做生产,正是想建立纯化平台的,又不知道如何下手。楼主有GE的销售或客服部门的电话吗?


我不知道您在什么区域

我在浙江这边,GE的试剂耗材找的国药,GE的设备找的是一个销售人员
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ritou1985[使用道具]
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楼主,那我想请问,你们所用稀释液怎么配置的啊?!
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