小中大【求助】请教各位大侠GST的蛋白纯化
大家好，小弟是个新手，最近用pGEX6P-3载体进行蛋白表达。
首先，做了一个空载体对照菌株的GST纯化，介质是Glutatione Sepharose 4B，与蛋白结合过夜，其他按照说明书进行，用的是过柱纯化，经PAGE电泳检测后，能够获得较纯的GST条带，含量也较高，这说明纯化的体系应该是没问题的；
其次，进行了目的蛋白的纯化，小量菌液（5ml）用0.2mM IPTG，28度，诱导4h后，取1ml菌超声（4S / 6S, 40 times，400W）破碎细胞，经WB检测后，目的蛋白确实是可溶，目的蛋白也具有酶活性，但表达量较低；
然后，进行大体积诱导蛋白(150ml )，用8ml PBS重悬菌体，用上述超声条件进行超声，直到菌液变清（30 min），其他条件和上面一样，也进行了WB确认和酶活检测，然后用Glutatione Sepharose 4B进行纯化回收目的蛋白（与蛋白结合过夜），对分别用PBS和还原型谷胱甘肽（10mM）洗脱buffer洗脱下来的样品进行检测后发现，只有PBS洗脱的样品中有蛋白（但不确定是否有目的蛋白）但没酶活性，而在还原型谷胱甘肽洗脱buffer洗脱下来的样品中，既无蛋白也无酶活性。
这个实验，从蛋白诱导到纯化重复了三次，结果都一样没能成功获得纯化的目的蛋白，重复性非常好，郁闷中。。。
望请各位大侠对上面的实验提些建议，改正和优化。
小弟也对下面的问题有些疑惑：
1. 如果目的蛋白表达量不高，那么一般是诱导多少ml菌进行蛋白纯化的？超声效果好还是用Novagen公司的Bugbuster的裂解液效果好？实验室经费比较紧张。
2. 融合蛋白与树脂结合的时间有具体要求吗？说明书上建议半小时。会不会树脂与蛋白结合得太紧洗脱不下来？
3. 采用不同浓度梯度的还原型谷胱甘肽进行洗脱会有效果吗？
4.再弱弱的问一个问题，是不是只有可溶性的蛋白才能结合上柱？
期待各位的回复，谢谢。
