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标题:【求助】关于蛋白质糖基化后分子量差距很大

vcve[使用道具]
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发表于 2013-5-10 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于蛋白质糖基化后分子量差距很大

大家好，我做的实验是将人胰岛素原加糖基化位点，在真核系统中表达，具体用的是昆虫细胞，结果表达出来的蛋白分子量是原来的2倍，也就是说按分子量算应该是个二聚体，一直不能解释为什么？麻烦大家知道的帮帮忙，我的导师出国了基本上管不了我，所以自己做起来很困难。
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-5-10 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么得出的分子量？如果不是用MS的话，可能得到的是不准确的。如果是用MS的，用蛋白酶切目标蛋白，随后再做MS确定位点。
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发表于 2013-5-10 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 kuaizige 于 2013-5-10 15:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

怎么得出的分子量？如果不是用MS的话，可能得到的是不准确的。如果是用MS的，用蛋白酶切目标蛋白，随后再做MS确定位点。

分子量是通过氨基酸数量算出来的，不是用MS算的，这个胰岛素分子量现在已经很清楚了
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发表于 2013-5-10 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的楼上意思是你表达出来的蛋白分子量是用什么办法测得的，SDS-PAGE？你的胶跑出来是什么样子？有糖基化的话应该是又宽又模糊的条带

[ 本帖最后由 qhyu 于 2013-5-10 15:32 编辑 ]
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-5-10 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实很简单，你可以买去糖基化酶进行消化后再跑胶就一目了然了
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发表于 2013-5-10 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 minran_1980 于 2013-5-10 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实很简单，你可以买去糖基化酶进行消化后再跑胶就一目了然了

我的实验原计划就是用糖苷酶F去切，验证到底有没有糖基化，但是我这个蛋白是收集的细胞培养液上清，而且不能纯化出来，所以加了糖苷酶后也没有反应。
分子量是用SDS-PAGE测的
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发表于 2013-5-10 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 vcve 于 2013-5-10 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我的实验原计划就是用糖苷酶F去切，验证到底有没有糖基化，但是我这个蛋白是收集的细胞培养液上清，而且不能纯化出来，所以加了糖苷酶后也没有反应。
分子量是用SDS-PAGE测的 ...

是跑的SDS-PAGE胶，因为表达量低所以在胶上看不出来目的蛋白，只能做WB转膜后显色再看，显色后就出现的条带在20kd那快，本来胰岛素原的分子量是10kd的。
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发表于 2013-5-10 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 qhyu 于 2013-5-10 15:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上的楼上意思是你表达出来的蛋白分子量是用什么办法测得的，SDS-PAGE？你的胶跑出来是什么样子？有糖基化的话应该是又宽又模糊的条带

是跑的SDS-PAGE胶，因为表达量低所以在胶上看不出来目的蛋白，只能做WB转膜后显色再看，显色后就出现的条带在20kd那快，本来胰岛素原的分子量是10kd的。
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发表于 2013-5-10 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
糖基化以后SDS-PAGE的行为是不一样的。
10kDa的蛋白带一个2k的N-糖链有可能在SDS-PAGE上的电泳速度和20KDa无糖基化的差不多。
也就是说糖蛋白的分子量不能通过SDS-PAGE来判断。
要知道精确分子量，只有纯化以后用MS进行测定。
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vcve[使用道具]
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发表于 2013-5-10 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 yes4 于 2013-5-10 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
糖基化以后SDS-PAGE的行为是不一样的。
10kDa的蛋白带一个2k的N-糖链有可能在SDS-PAGE上的电泳速度和20KDa无糖基化的差不多。
也就是说糖蛋白的分子量不能通过SDS-PAGE来判断。
要知道精确分子量，只有纯化以后用MS进 ...

你好，很感谢您的意见，我的实验设计的时候是导师设计的，他没有加标签，所以后来也不好纯化，再加上在细胞里面表达量很低，也很难纯化，我也觉得相差很小的分子量蛋白在胶上几乎看不见，但是导师非要让我做出来结果，相当郁闷呐
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