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标题:【分享帖】His tag 的功与过

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发表于 2013-5-10 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】His tag 的功与过

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先介绍一下His Tag，为5-15 His 串在一起的小肽， 在表达纯化中用的较为普遍的一种Tag, 从本质上说它是一种亲和性Tag，但也个案证明其也能做一些兼职工作：增加蛋白可溶性，提高蛋白稳定性。但它的本质工作是与IMAC亲和，使纯化过程变的更加程序化，更具可控性。

相对与其他亲和Tag,如 GST, Flag, Strep, 它的特点可谓鲜明：

一，小，浓缩的都是精华，6个His 放在一起约2.5KD大小。His 的等电点为7.6，在常用的纯化缓冲体系（pH 8.0）中几乎不带电荷。所以这么小的Tag对passenger蛋白本身性质的影响是非常小的。

二，廉， 纯化带His Tag蛋白的成本相对于其他Tag来说，是最便宜的。对His Tag来说, 每克填料约10刀，配1 L 洗脱缓冲液约7元; 而GST Tag，每克填料9刀，配1 L 洗脱缓冲液约70元; 对于 StrepII, 每克填料约20刀，配1 L 洗脱缓冲液约700元。其他的标签就不说了，因为填料的价格就不在一个数量级呀，要贵的多。从使用成本上来说，His Tag 的优势再明显不过了。

His Tag这两个优点使它一直占据Tag家族老大的位置，可谓家喻户晓。但是千万别被这些光环恍了您的眼睛。它并不是完美无瑕的：

一，最常见的就是加了His Tag后，不挂柱。通常解释为Tag 无游离性，折叠到蛋白内部了。解决办法就是在蛋白N/C两端分别加上Tag，或者使用其他Tag，另外就是将蛋白变性后上柱。

二，对于一些容易被氧化的蛋白，个人建议最好别用His Tag。这些蛋白在纯化过程中，要加入还原剂防止蛋白被氧化，IMAC是比较忌讳这些还原剂的，当然你可以选用tris-(2-carboxylethyl)-phosphine(TCEP)作为还原剂，因为它不还原金属离子，但成本太高了。这些容易被氧化的蛋白，特别是一些激酶，在加了His Tag 后，会在纯化过程中，显得很不安分，经常会形成沉淀，不容易被浓缩。遇到这些让人头疼的问题该怎么办？要么放弃亲和纯化方法，选用离子层析等其他纯化方法；要么放弃His Tag，选用其他Tag。

Tag 非圣贤，孰能无过。只要充分了解His Tag 的优缺点，才能充分利用其，是纯化简单可控！
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youyou99[使用道具]
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发表于 2013-5-10 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
His-tag 不挂柱，另有一个说法，His 跟 蛋白质表面的极性基团形成较多的氢键，就像被胶水粘在了蛋白质表面，而降低与 IMAC 的结合能力。相比较 His-tsg 折叠到蛋白内部 的说法，我认为前者更有说服力，蛋白质内部的结构也不疏松，那么大一个 HisTag 应该不是很容易在内部找到藏身之所。
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 小中大

回复 #2 youyou99 的帖子

嗯，His tag 理论上会出现在蛋白的表面，毕竟His其属于极性氨基酸。
谢谢你的补充
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发表于 2013-5-10 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两种说法都有一些道理，但个人认为还不是全部。我在工作当中遇到过多种his-tag的包涵体蛋白，有一些在8MUREA或6M胍、强还原剂条件下依然不能有效吸附到IMAC柱，不管是GE的Chelating、HisPrep、Ni-Shepharose还是Qiagen公司的Ni-NTA或国产的Ni胶，而且这些样品同样不能吸附到离子交换柱，疏水柱等，即使将UREA除去后也不能吸附到IEC或HIC柱。
所以，我想就此现象来分析，UREA或胍可以打开包涵体蛋白中的所有疏水键、氢键、离子键，强还原剂可以打开二硫键。所以蛋白在理论上应该是一条线性多肽链。不能吸附到我们常用柱的原因只能在于整个蛋白的多肽链被某种物质所覆盖（破菌液和包涵体溶解液中无任何表面活性剂），使其不能表现出电荷特性和亲和特性。
就此蛋白的种类来说，往往是一些本身疏水性较强的蛋白。结合的物质是什么我至今也是一头雾水，怀疑是一些小分子的物质，因为SDS-PAGE并未显示分子量大的变化；曾经怀疑过菌体的核酸，因为包涵体中核酸含量较高，但核酸带负电，在正常条件下应吸附到Q这类阴离子交换柱，蛋白也可以吸附了（低pI蛋白），操作中却完全不吸附。碰到了这样的蛋白只好放弃纯化。
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发表于 2013-5-10 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我狗尾续貂好了说实在的,不吸附的蛋白是会有的,通常10个蛋白有2-3个这样的例子,但是这和填料选择和操作方法有很大关系,特别是填料的选择,通常情况下,大多产品为特异性可用两个方法,1.选择降低配基密度,2,选择减少配基的结合价位,这样还可以提高耐受还原剂的强度,其实这非常没必要,特别是选择TED这样的配基,只剩余一个集合位点,NTA, CM-ASP有两个,IDA有三个,所以如果结构完全相同,那IDA无疑是作用力最强的,此外通常IDA配基的配基密度都高于别的,因为成本而且好偶联,但是这还有个关键问题是合成填料手臂,有的填料手臂过短,那就难结合一些标签在内部的蛋白.我们见过一些挂不上的,但是当换配基密度高的就没问题,此外耐受还原剂其实只要把镍离子换成钴离子,多少浓度的还原剂都不会影响,所以说填料是很微妙的,至少现在我很少听到客户说挂不上的.所以填料选择是很重要的.至于特异性和吸附的条件有很大关系。所以镍柱颜色越深，配基密度也越高，吸附力也越强。
此外还有一些是细节问题，有时候变性条件下载量不高，而如果用的填料过少，上的样品又少，所以没结果，这也是一种现象。
此外包涵体还可以选择分级稀释沉淀的方法去纯化，以前说过，还有就是盐酸胍确能使一些尿素挂不上的可挂上，关键是留意pH,总之纯化其实是种经验性的工作,需要多实践,所思考,多交流.如果什么现象都见过,那自己就会更有把握点,我不是很赞成这样包涵体选择离子柱等,特别是凝胶柱去纯化,能用亲和是最好的选择.
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发表于 2013-5-10 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只要把镍离子换成钴离子,多少浓度的还原剂都不会影响

那么 也不会受 DTT 的影响吗？ 如果真这样 那可太好了，要知道很多蛋白质，必须要加 DTT 保护。
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发表于 2013-5-10 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真是这样的,因为钴离子不会被通常的还原剂还原,包括DTT,试试就在知道.
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发表于 2013-5-10 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

标签，长了影响蛋白结构尤其是活性，比如gst
短了，特异性降低，比如his，
重要的是看你的蛋白

制备抗体，不用活性，gst好纯化，
要活性，his首选
但是建议最好先分析一下自己的蛋白序列，如果里边没有his的影响或较小，
个人建议还是histag
但不论如何，亲和只是方法之一，离子交换通常是个重要的甚至必须的补充
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 小中大
在TALON® Metal Affinity Resins 的使用说明书上这样写的：
These reagents are incompatible at any concentration:
• DTT (dithiothreitol) and DTE (dithioerythritol)
Note: Use of strong reducing agents will interfere with the binding of the cobalt
metal ions to the resin.
也就是说钴跟DTT是不相容的。不知chromatography是怎么考虑？是填料的原因？
我们也打算试试，能给下简单的方法？
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gemei0115[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 vcve 于 2013-5-10 16:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我狗尾续貂好了说实在的,不吸附的蛋白是会有的,通常10个蛋白有2-3个这样的例子,但是这和填料选择和操作方法有很大关系,特别是填料的选择,通常情况下,大多产品为特异性可用两个方法,1.选择降低配基密度,2,选择减少配 ...

但还有一个问题没有解决，如果改变IMAC介质可以使HIS蛋白挂柱，为什么离子交换柱不能吸附呢？蛋白的电荷特性跑哪儿去了？
我对这些种蛋白试验过高pH的Q柱（pH9-10），融合蛋白的理论等电点5-6，低离子强度（<1ms/cn）下平衡缓冲和样品溶液，这些不吸附IMAC柱的his蛋白也完全不吸附Q柱。
我们在做E.COLI.重组蛋白纯化过程中，也会看到一些菌体自身的蛋白有这种特性。比如说，我们在pH9-10的条件下用Q柱纯化破菌上清（保证柱不过载），必然有绝大部分蛋白不吸附到柱上而穿透，吸附的蛋白种类相对是少量，这可以通过电泳来验证。而将这部分Q柱的穿透通过透析降低pH到5-6，再上样SP柱（保证柱不过载），仍然有很多很多蛋白不能吸附。排除电导的影响后，应该可以得出这样一个结论，那就是有一些菌体蛋白不吸附离子交换柱，不具有蛋白应有的表观电荷特性。当然这是试验现象，本质上不应该如此，一定有我们还不知道因素在里面。
希望大家能就此多多讨论，大家可以共同学习，提高我们对蛋白纯化的认识。
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