小中大【求助】搞了一个月的western，条带出的很诡异
最近一个月做western，总是做不出条带，非常的郁闷。下面是我近一次做的实验步骤，还请高手指点：
1.蛋白上样量为40ug，每孔20ul。
2.12%的分离胶，电泳浓缩胶70v，分离胶100v，电转100v 2h。
3.7%牛奶封闭半小时，一抗是santa的，4°过夜。二抗是国产的，浓度1:1000，室温孵育1h。
4.压片的时候，没有看到明显的荧光，压片时间3min左右，条带基本可以看到，但是背景很糊，有很多杂带（红色箭头为应出的条带，绿色是maker），压第二次的时候，所有的条带都没有出来，于是我补了发光液，还是什么都没有压出来。
5.考虑可能二抗效价不好，所以TBST洗膜5min，然后重新孵育2抗，浓度1:500，再次压片，还是什么都没有，连杂带都没有。
6.用TBST洗膜40分钟，室温孵育b-actin 2h，压片结果什么都没有。
7.重新用一抗二抗清除剂清洗膜，然后封闭1h，孵育另一种一抗（santa）过夜，今日压片仍然什么都没有。
8.同学建议我用丽春红染一下膜，看看有没有蛋白，我在压完膜后将膜用TBST洗过10min（不知道有一抗二抗在上面会不会有影响），加入丽春红15min，膜上并没有看见条带。
我现在是特别的痛苦啊，而且近一个月的状况基本都是这样，实在不知道问题出在哪里，求大侠救命！
