蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白表达量低怎么办

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标题:【求助】蛋白表达量低怎么办

lagua123[使用道具]
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发表于 2013-5-10 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达量低怎么办


用western blot技术做了一个蛋白一个学期了也没做出来一幅像样的结果，我的蛋白表达量低怎么办，加大上样量还是不行，条带淡背景高，不知道把一抗四度2-3天，二抗4度2-3天行不行，希望大侠们给以指点！
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发表于 2013-5-10 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这样做没必要，如果一抗过夜都没有，再加长时间也就没用了，二抗更不能过长，否则有可能增加背景。对低表达量的蛋白除了浓缩或者想办法增加表达量外，可以想办法买支好点的一抗。不知道作者做的是什么蛋白？说出来可能大家能给你点好的信息和好的办法。
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发表于 2013-5-10 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是4-hne，一个氧化应激的marker，一直做不出来像样的条带。我买的抗体是RD公司的，这支抗体带本身就很多，我见用这支抗体的文献给了好几个带，我想增加一抗或二抗的孵育时间但是怕杂带会更多。
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发表于 2013-5-10 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lagua123 于 2013-5-10 17:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做的是4-hne，一个氧化应激的marker，一直做不出来像样的条带。我买的抗体是RD公司的，这支抗体带本身就很多，我见用这支抗体的文献给了好几个带，我想增加一抗或二抗的孵育时间但是怕杂带会更多。 ...

我看了RD公司这个抗体的说明，我没接触过你研究的这个领域，但我谈谈我的看法吧，这个抗体是针对4-hne的组氨酸聚合物，既然是聚合物，我想聚合的状态应该是有差异的，因此分子量大小可能不是固定的，应该是连续的，我注意到图中最后一个泳道用4-hne处理的hepG2出现了弥散的信号，所以不要被弥散吓住，不知道你做出来的图是否也是弥散的呢？你可以做个阳性对照，这样可以检测是否抗体出了问题，否则联系经销商退货或者换抗体，如果抗体本身没问题，那就有可能确实你的样品检测不到，可以考虑换思路或者别的什么。
以上意见仅供参考，本人确实没做过你这个领域的研究，如有不妥，望见谅。
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-5-10 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很感谢您的回答，我这支抗体别人用过，别人做的是心脏，能做出来，条带是很多，说明抗体应该没问题，就是质量不太好。我检测的脑组织内的表达，一直做不好。我做的组织内有这种蛋白表达，感觉就是量比较少，还没查到相关的文献，难道真的是设计问题？天啊，真不敢想！
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发表于 2013-5-10 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

顶“思路迪腺病毒”，确实应该做个阳性对照，这样一下子就能说明到底是抗体不行呢，还是脑组织内蛋白太少的缘故。
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发表于 2013-5-10 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

裂解组织提取蛋白的试剂能否改善一下？
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发表于 2013-5-10 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

组织裂解做western是比较难的，看作者的图就知道了，一般在细胞内GAPDH做出来不会这么杂。所以一般都是选合适的细胞系来研究，作者可否根据课题变换一下思路？
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-5-10 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的结果图不是GAPDH杂,是目的条带杂,因为我的目的条带在GAPDH(36kd)以下还有带的，内参就一条．我用的ＲＩＰＡ（强）＋ＰＭＳＦ来提取蛋白的，蛋白浓度还是很高的，不过我的这支抗体是单克隆的，是我提取蛋白时破坏了那个结合位点？
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发表于 2013-5-10 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否破坏了结合位点很难确定
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