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标题:【求助】LC3western 求助

superboy[使用道具]
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发表于 2013-5-10 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】LC3western 求助


我最近在做自噬相关蛋白LC3western，我配的是15%的胶，PVDF膜：0.22，转膜我分别湿转200MA30分钟，150MA50分钟，干转15V30分钟都试过但是都没有结果，转完膜后丽春红染膜大分子量都有条带但是分子量26之下的都没有条带，我的抗体没有问题。请问是哪个环节出现了问题，是不是与蛋白酶抑制剂有关，我用的是赛百盛的蛋白裂解液。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-5-10 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说说我的意见

（1）首先肯定，如果26以上的分子量蛋白都有，那么就证明转膜没有问题，大分子量的蛋白都转上了，小分子量的蛋白没有转不上的道理。当然我的转膜电流和时间都是比楼主的大得多和长得多的。我试过300ma，80min湿转都没有问题。

（2）如果抗体（这个必须排除）和转膜没有问题的话，那么出现问题的地方最可能的就是电泳了。

第一要排除，小分子量的蛋白是不是跑丢了，不知道您跑的多长时间，LC3-1和LC3-11的分子量分别是18，16,，所以必须保证11这个分子量的marker还在。 如果marker都不在的话，那就是跑丢了

第二，你要观察26分子量一下的marker是不是非常清晰，如果26以上的marker清楚，而26一下的marker不清晰的话，你就要找找是不是电泳液或者配的胶的问题了。

总之，排除的次序依次是抗体——转膜——电泳——胶

自己认真总结下吧
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vera+[使用道具]
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发表于 2013-5-10 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的条件是200mM湿转2h，裂解的时候就蛋白酶抑制剂就加了PMSF，用的sigma的多抗，很好压的，而且抗体反复用N次都是很亮的条带，你怎么确定你的抗体没有问题？
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superboy[使用道具]
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发表于 2013-5-10 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼上你做的也是LC3?
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superboy[使用道具]
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发表于 2013-5-10 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那请问你的膜用的是0.22还是0.45啊？还有转膜滤纸是薄得还是厚的？
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发表于 2013-5-10 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是0.2的膜，滤纸就是普通的滤纸折成8层用的,不过我觉得最关键的是你的抗体好不好。
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applebook=213[使用道具]
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发表于 2013-5-10 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜0.22um还是0.45um无所谓，都用过，没什么区别

手里有什么样的就用什么样的，抗体好，才是真的好

记住这句话就行了，抗体不行，神马都是浮云
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superboy[使用道具]
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发表于 2013-5-10 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是我转后染膜，膜上就没有条带啊
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-5-10 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丽春红分辨率有限，小分子量区域看不到条带并不代表你没转上，你的预染marker相应的位置应该能看到条带吧。
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flower-201[使用道具]
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 小中大

哈哈，看来LC现在真的是热的很哇：）

抗体的确很重要的啊，但不排除PAGE本身在低分子区出现问题的可能。
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