小中大【求助】Western blot实验加入发光底物后未见光...
高人求助！
最近做western blot总是很不稳定，同样条件有时出有时不出结果，不知道什么原因？
前几天做了一便，曝光后结果很好。昨天又做了一遍，今天曝光后白板，很郁闷~
具体步骤如下：
目标蛋白：38kd
1,12%分离胶， 5%浓缩胶
2，电泳 浓缩胶 80V电泳10min
分离胶120V电泳1h20min
3，电转 120V电转1h
5,封闭 5%脱脂牛奶室温封闭1h
6,一抗 0.5%脱脂牛奶(TBST配) 1: 1000 (推荐浓度为1:2000）稀释 4°摇床过夜
TBST 10min x2,TBS10min x1
7，二抗 0.5%脱脂牛奶(TBST配) 1: 2000 室温1h
TBST 10min x2,TBS10min x1
发光液1:1混合后覆盖于膜上，暗室曝光，结果:胶片无任何条带影像，白板一块，原因不明？
附注：一次跑的四块胶，转四张膜，一抗二抗四张膜都同时进行。之前做过一批四张膜结果很好，这次按上次同样流程走，却结果什么都没有。发光底物反应后暗室下未见荧光，另外排除二抗及发光底物，以及显影定影胶片的问题。转膜估计问题也不大，本然猜测是不是在封闭-一抗-二抗或者哪个没有注意到的细节上出了问题，请高人指点！
