【求助】蛋白的点杂交

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标题:【求助】蛋白的点杂交

bohe221[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助！蛋白的点杂交。
只能搜到DNA和RNA的点杂交protocol，求教如何做蛋白的点杂交。
请各位指教，谢谢！

hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道战友求助的是哪方面，如果是研究mRNA表达蛋白的点杂交，少量的话要用到His-tag以及地高辛抗体，这个在分子克隆指南里面有，就不多说了，大量的话要用蛋白芯片，即多个蛋白的点杂交，这个现在相关文献也很多。
如果研究蛋白和它抗体的点杂交的话，那就是DIBA（dot immune blot assay），就是把你的蛋白点到NC膜上，然后加一抗，加二抗，其实就是一个Dot-ELISA，用DAB显色，效果很好的。
希望可以解决你部分问题

yes4[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也正需要了解这方面的内容，请问点样至NC膜后，如何干燥和固定好呢？

7437654[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将待检蛋白用包被液稀释，用微量加样器点于硝酸纤维素膜（NC）上，置于37℃（此步要干燥备用的话可以用70°）经1h，将NC浸于1％BSA－PBS中封闭，室温摇荡1小时，洗涤3次，加抗体，37°1h后洗涤3次，加二抗，1小时后，洗涤3次后，加DAB

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发表于 2013-5-11 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢。还请问这里的包被液指的是一般ELISA使用的包被液吗？还有，封闭液用加BSA的TBST可以吗？

pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是的，就是这些东西。
不过，我也直接把溶解的蛋白质点到膜上过，室温下干燥，以后步骤相同，结果也杂出来了。

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谢谢。还请问这里的包被液指的是一般ELISA使用的包被液吗？还有，封闭液用加BSA的TBST可以吗？

bamboo16[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们的方法是先把NC膜在转膜缓冲液中泡15min，然后室温晾干15min,把蛋白直接点在膜上，晾干10min,封闭、孵一抗二抗，曝光，就可以了

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将待检蛋白用包被液稀释，用微量加样器点于硝酸纤维素膜（NC）上，置于37℃（此步要干燥备用的话可以用70°）经1h，将NC浸于1％BSA－PBS中封闭，室温摇荡1小时，洗涤3次，加抗体，37°1h后洗涤3次，加二抗，1小时后，洗涤3次后，加DAB

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请问：一抗二抗的配制液体是否和封闭液一样？还有，封闭用5%脱脂奶粉行吗？

bohe221[使用道具]
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发表于 2013-5-11 13:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问：一抗二抗的配制液体是否和封闭液一样？还有，封闭用5%脱脂奶粉行吗？

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一抗二抗的配制液体可以用TBS-T，也可用10%脱脂奶粉（注意奶粉容易变质，影响结果），封闭液是10%脱脂奶粉。