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标题:【求助】DAB可以显色 ，为什么ECL显色没有背景和没有条带

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发表于 2013-5-11 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】DAB可以显色 ，为什么ECL显色没有背景和没有条带

ECL显色在暗室片盒看不到发光，曝光没有条带，重新洗膜，再加二抗，用DAB显色很快就可以看到条带，是不是ECL不能用了，可是取少量ECL混合液加二抗可以发光，到底是什么原因啊
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发表于 2013-5-11 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.二抗洗完膜后配制ECL发光液，在暗室没有荧光出现或有一些背景光，但是没有看到条带出现。
2.回到实验室重新洗膜，再加二抗，孵育1个小时（同前），用DAB 显色，不到5秒立刻出现明显的条带。
3.开始怀疑是ECL失效。取适量的AB液混匀，加一微升二抗，在暗室立刻可以看见的荧光，发光液变成棕黄色
4.开始也怀疑蛋白表达量很低，所以现在逐渐加到150微克，可是现在也没有看到荧光或者有微弱的背景光。
5.一抗是1:100或者1：200（推荐1：100-1：400），二抗1：2500（推荐1：2500-1：6000）稀释
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箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先检查显影和定影有没有问题。
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发表于 2013-5-11 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-5-11 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

先检查显影和定影有没有问题。


今天根本就没有荧光，干脆我就没有曝光，昨天虽然没有荧光也曝光了，但是没有条带，再说个根本就没有光，连背景和杂带也没有，我的显影剂和定影剂都是新配的，以前都是都是看到荧光再压片。
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发表于 2013-5-11 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还用新的ECL试试吧！很可能是ECL的原因。
你也可以把ECL加在一起在暗室看看有没有亮光，有的话就不是ECL的原因。
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发表于 2013-5-11 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

开始怀疑是ECL失效。取适量的AB液混匀，加一微升二抗，在暗室立刻可以看见的荧光，在有光线的地方发光液变成棕黄色
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发表于 2013-5-11 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加大二抗浓度试试吧 加ECL之后立即到暗室观察
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发表于 2013-5-11 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不知道你加的二抗来检测ECL的，是原液还是稀释过的。应该用稀释过的。如果用原液除非是你的ECL真的是一点用都没了，不然这么高的二抗，都会出荧光。在目的带上看不到荧光也是很正常的，压片后照样是可以有结果的。
加好ECL后，避光孵育一会儿，然后压片，动作要快，不然有的淬灭快的话，就有可能出不来。这些操作最好都在暗室里进行。
你这样的情况，进暗室，先爆张你说看得见荧光的片子，看看后面的显影定影有没有问题，不要说是新配的，就省去这一步，因为你现在是出了问题了，那只能一个一个去排查。如果这一步没有问题，那我看就要调整你的一抗二抗浓度，做好有一个阳性的样品，带着一起做。
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wsll[使用道具]
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发表于 2013-5-11 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们也被这个问题困扰，换了生物素标记二抗，又加了个亲和素标记的HRP后，能发光了。我们学校好多实验室被这个问题困扰了
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发表于 2013-5-11 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们也被这个问题困扰，换了生物素标记二抗，又加了个亲和素标记的HRP后，能发光了。我们学校好多实验室被这个问题困扰了

是不是需要两个互抗的二抗，一个是生物素标记的二抗 一个事HRP标记的二抗，能详细的说明一下吗，谢谢，期待你的答复
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