【求助】leaved caspase-3做不出来，麻烦大家帮帮忙

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】leaved caspase-3做不出来，麻烦大家帮帮忙

18 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】leaved caspase-3做不出来，麻烦大家帮帮忙

lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-5-11 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，我是用的抗体是CST（9664）的cleaved caspase-3（17/19kD），没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3（35kD）
组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
上样量：为60微克/lane；10%的胶（细胞色素C14kD跑出来了，但cleaved caspase-3没出来）
电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2（我同时跑的两块胶，胶总面积为16.6cm2，所以我转膜的电流为16mA），时间按照分子量定（1min/kD），选择了19min
封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
洗膜：PBST洗10min*3遍
显色：ECL显色

注：1.同样的胶和转膜方法，同时做的细胞色素C（14kD）就做出来了，不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的，不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来，

实验老是做不出来，也怕被怕被老板说，着急啊~~~~
请问大家，我上面的步骤有问题吗？非常感谢~~~~

nikonun[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 107972
精华 0
积分 218
帖子 176
信誉分 100
可用分 1636
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态离线

发表于 2013-5-11 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分离胶用15%的试试，有预染marker的话，加一道预染marker。

lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-5-11 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 nikonun 于 2013-5-11 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

分离胶用15%的试试，有预染marker的话，加一道预染marker。

膜上marker是有的，说明书公司也配了的。
就是不知道是不是我的实验组caspase-3没有激活~~
找了个阳性对照，下次试试~~

BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态离线

发表于 2013-5-11 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我把我的实验条件给你
我也用的CST的抗体，这个抗体识别剪切前和剪切后的caspase-3
电泳：80V,30min/120V,1h跑到底为止
转膜10V，20min,膜是PALL家的，NC膜1200.
一抗：1:1000.4度过夜。注意孵育均匀
10min/3次
二抗：1:4000.室温1.5h.
同上
发光液：5min,ECL家的
效果不错，没有跑不出来过。

lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-5-11 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 BOSS2011 于 2013-5-11 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我把我的实验条件给你
我也用的CST的抗体，这个抗体识别剪切前和剪切后的caspase-3
电泳：80V,30min/120V,1h跑到底为止
转膜10V，20min,膜是PALL家的，NC膜1200.
一抗：1:1000.4度过夜。注意孵育均匀
10min/3次
二抗：1:4000.室 ...

你好，谢谢~~
我买的是只识别接切后的抗体的（17/19kd），哎，无语了，应该买那种连35kd也识别的就好了
请问你是用的全蛋白还是浆蛋白？上样量和胶的浓度是多少？转膜是半干转吗？
谢谢~~

IAM007[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75217
精华 0
积分 464
帖子 608
信誉分 100
可用分 3861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2013-5-11 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

全蛋白诶，30ug.我的文档里面有不同分子量对应的胶的浓度。。。呃这么小的分子量当然是半干。。。。。。。

BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态离线

发表于 2013-5-11 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，谢谢~~
我买的是只识别接切后的抗体的（17/19kd），哎，无语了，应该买那种连35kd也识别的就好了
请问你是用的全蛋白还是浆蛋白？上样量和胶的浓度是多少？转膜是半干转吗？
谢谢~~

============================================

你参考这个，????cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/24257970')
里面有不同的分子量，对应的胶的浓度。我一直用，都不错。

lxh031[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76425
精华 0
积分 335
帖子 389
信誉分 100
可用分 2726
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-5-11 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 IAM007 于 2013-5-11 17:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
全蛋白诶，30ug.我的文档里面有不同分子量对应的胶的浓度。。。呃这么小的分子量当然是半干。。。。。。。

其实我做cyochrome-c（14kD），用的是10%的胶，也可以做出来的
你用的是多少浓度的胶啊？下次准备试试12%或者15%的。

BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态离线

发表于 2013-5-11 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 lxh031 于 2013-5-11 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实我做cyochrome-c（14kD），用的是10%的胶，也可以做出来的
你用的是多少浓度的胶啊？下次准备试试12%或者15%的。

http://d.dxy.cn/detail/4630874我们实验室的SOP

BOSS2011[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74568
精华 0
积分 427
帖子 534
信誉分 100
可用分 3476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态离线

发表于 2013-5-11 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛮好跑的，你试试。

18 1/2 1 2 ››