【求助】原核表达不能诱导目的蛋白

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标题:【求助】原核表达不能诱导目的蛋白

minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，真心向大家求助一个原核表达的问题。

我的基因是低等真核动物中的名叫山梨醇脱氢酶的一个基因，ORF长为1047bp,用PET30a作为原核表达的载体，所用的内切酶为上游是BglII,下游是Xhol，经过一系列的实验，进入到表达阶段，说明测序一切正确。稀有密码子有20个，平均分布在基因序中，表达菌株第一次用为BL21，用浓度为1mM,0.25mM，分别诱导3个小时，37，120转，都诱导失败。又换用rosetta表达菌株，同样浓度梯度，也诱导失败。如今不知道问题到底出在哪个地方。希望有经验的实验师兄师姐能给予一定的帮助，非常感谢！

yychen[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如何知道没有表达？可以尝试低温诱导，转速可以加快一点，180

minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yychen 于 2013-5-13 15:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如何知道没有表达？可以尝试低温诱导，转速可以加快一点，180

跑PAGE电泳看呢呀。没有带。

daod[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 minran_1980 于 2013-5-13 15:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

跑PAGE电泳看呢呀。没有带。

表达量低的话看不到带不奇怪，可以考虑一次摇500ml菌液尝试纯化

chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用的BglIII酶切位点，那么设计引物的时候有没有考虑你的基因的读框和前边一致？

PINK[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议把稀有密码子优化了或者换宿主菌和质粒，如Pet22B ,BL21 plyss 等

minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 chenshuanhe 于 2013-5-13 15:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用的BglIII酶切位点，那么设计引物的时候有没有考虑你的基因的读框和前边一致？

什么意思呢？

hyuu[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠，我表达的是犬干扰素的成熟肽，共492bp，用的是pGEX-6P-1，宿主是BL21，我预测了一下表达融合蛋白的大小，在44.9KD，但从我跑的结果来看，在这个位置好像有菌体蛋白，不同ITPG浓度有到后，感觉表达量也没什么明显的差别，用的是37度，有的大侠说可能是没有表达，这种情况该怎么改进实验呢？比较急啊

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-5-13 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以尝试２０度诱导，还有摸一下诱导的od值条件。