【求助】双分子荧光互补（BiFC）的荧光蛋白的选择

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标题:【求助】双分子荧光互补（BiFC）的荧光蛋白的选择

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，

最近想做双分子荧光互补检测蛋白相互作用，查了些文献，荧光蛋白基本选用的都是黄色荧光蛋白（YFP），由于我这里没有此载体且观察条件不具备，所以想用GFP或红色荧光蛋白代替，不知可否？那么应该怎么选择荧光蛋白的切割位点呢？请做过的战友指教。谢先！

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这两天又仔细看了几篇文献，我就说说我的看法吧，也请大家帮我参考一下。
02年Molecular Cell一篇文章首先介绍了这种方法，主要是用来检测转录因子的相互作用。它用的是EYFP的1-154和155-238aa片段分别连在欲检测蛋白一端（还进行了一系列的试验寻找最佳可行的分割片段），如果蛋白相互作用，两个YFP片段靠近，激发产生荧光。其后的几篇文章大多均采用此文章的方法。只有在04年PNAS的一篇文章，介绍了用BiFC的方法观察泛素化蛋白的方法（的确是好方法！），他用的是YFP的1-172aa和CFP(蓝色荧光蛋白cyan)155-238（搞不懂哪来这么多荧光蛋白！）两个片段共同激发荧光。

我根据Molecular Cell的那篇文章提供的几个特定位点氨基酸找到了他们所用的YFP是clonetech公司的pLP-EYFP载体上的YFP，与pEYFP载体的YFP不同！
然后拿这个序列跟GFP比对发现他们竟然有90%多的一致！再仔细看他们的载体说明，晕！原来YFP是GFP的变体蛋白，只改造了几个aa。

通过它们的三维结构看，1-154aaYFP包含了整个桶装蛋白片层结构的大部分，且最后约10多个aa片层在另外四个片层之间。GFP如果按此进行分割则具有同样的特征。
所以我想，GFP是不是应该可以按照YFP的分割方式进行？它的三维结构是不是能够说明这样的分割方式最佳？

抛砖引玉，希望诸位战友能够提些建议。

YFP：蓝色部分是1-154AA，第154aa用红色显示。

附件

2013-5-13 16:28

56317340.gif (15.21 KB)

youyou99[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也有做一下BiFC的打算，请问您现在决定怎么做了么？

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我就说说我现在的情况把，希望对你有用。

现在再回头看当时的想法，的确是有很多不完善的地方，主要原因还是当时文献查的不充分。
我首先是按照当时的想法构建了GN154和GC155，但结果并没有预期的荧光出现，于是又重新仔细查了文献才发现，nature在03年又有一篇同一作者的文章，是介绍多重双分子荧光的，那篇文章对GFP、YFP、CFP等几种荧光蛋白均作了不同切割方式的组合，其中就已经发现GFP不论怎样分割都不会有荧光出现的。看到这篇文献后，我狂吐血！
于是，我根据那篇文章的结果重新构建了载体，还是由于没有YFP的原因，我采取了GN173和CC155的组合，CC155与GC155仅在N端不远处仅有一氨基酸不同，我采用了定点突变的方法从GFP获得CC155(我也没有CFP,晕！)，构建好载体之后，原本以为可以了，转染细胞之后才发现还是不行。无奈之下，给作者发了个Mail询问原因顺便也想直接要点质粒，老外说GN173和CC155的组合的确可以发荧光，但是会很弱（produces very low signal），建议我采用YN173和YC173组合。看了之后，我又是狂吐血！近两个月啊。。。。。

所以，至今我还在为这事犯愁。。。

如果你想做，建议你还是采用老外的建议，以免重蹈浪费时间精力的覆辙。如果哪位战友能慷慨提供YFP或CFP(Clontech)质粒，那本人更是感激不尽！

有时间我会再把那篇03年文献传上来，以供参考！

2003 Simultaneous visualization of interactions between multiple proteins in living cells using multicolor bimolecular fluorescence complementation analysis
1.15M,好大，传不上来，可以通过NCBI查得到。

wood533[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我看了那篇paper 了，xray19你可以和老外要一下那些质粒。谢谢你的经验和教训！

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问问题，老外很热心，一提到要载体，就没信儿了。
还是自己再想想办法吧

66小飞侠[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，gfp只能在157和158之间切。

ffooll[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，
谢谢你的建议！我要到了YFP，准备构建YN173和YC173，再看看吧
不成功便成仁了。。。呵呵

ffooll[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有诸多战友翻到这篇老贴，短信问我BiFC的情况，由于这个账号目前较少使用，导致有些战友的问题没有及时解答，现将当时实验的结果简要解释下，希望能对需要的战友有帮助。
荧光蛋白的选择，建议先看看这篇综述 Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research，这几年这方面发展很快，已有多种荧光蛋白证实可用于BiFC。
我当时用的是yfp，分别在173位置和155位置切割，173构建入 pCMV-HA载体，155为老外赠送。所用细胞主要为293FT，后来也在HeLa，AML12, CV1等细胞进行验证，有相互作用的蛋白均可以发出明显荧光。
一般是转染后30h，将细胞由37度培养箱转移至30度，继续孵育3-4h，这样大大会增强荧光的产生。不过，近来发展的利用VFP等荧光蛋白，对温度的要求大大降低。

附件

2013-5-13 16:33

88808233.snap.jpg (24.46 KB)

yonger[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做BiFC是找国外人要的！

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