【求助】求助western blotting检测小分子蛋白的经验

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标题:【求助】求助western blotting检测小分子蛋白的经验

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发表于 2013-5-13 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教哪位WB高手，我现在做人β防御素2（hBD2）的WB检测，蛋白标本来自肺上皮细胞总蛋白提取液，我的分离胶用15%的胶，上样量为80ug/孔，电泳条件为70v（浓缩胶）、120v（分离胶），电泳后marker在胶上清晰可见，最小分子量的一条marker为10kd也可以清楚看到，我的目的蛋白hBD2分子量为7kd（abcam一抗，说明书上提示该产品分子量为7kd），故电泳后切胶时，在10kd以下切1cm宽的胶进行转膜；“三明治”夹的搭建应该没有问题；我的转膜条件为：湿转，300mA，50min，用的膜是0.22um PVDF膜（millipore）；5%脱脂牛奶室温封闭1.5h；abcam一抗1：750 4°C孵育过夜，HPR标记二抗（进口分装）1:2000，室温孵育2h；洗膜均为TBST（含0.1%吐温）10min×3次；最后ECL发光（pierce公司产品），内参选用GAPDH，内参条带非浓，很容易曝光，但是目的蛋白至今未能做出来（已经近1个月了），心情极度沮丧，不知哪位老师能指点迷津，哪些步骤需要改进？期待您的回复，非常感谢！
另外说明一下，我提取的总蛋白，做其他指标（分子量为100kd，转膜条件为300mA，1.5h，用的膜为0.45um）是有条带的，可是是做hBD2没有任何条带让我看到！

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

300mA这么大的电流，蛋白又那么小，肯定转过了！我转过ChLYZ的，分子量只有14.5kDa,转膜30mA,30min,条带相当好看~你可以试试

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发表于 2013-5-13 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼上，你用的也是湿转吗？据我现在查看的有关WB技术资料，30mA这么低的电流，好像是半干转的吧？！
我好困惑啊！

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发表于 2013-5-13 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近查看了好多帖子，有的说“10kd的目的蛋白，湿转，恒压80v 90min或者横流200mA 90min左右转膜，我敢保证不会转超过去”，还有的说“10kd的目的蛋白，湿转，300mA，40-50min”，我真的好困惑，到底怎样比较好，还是多没有关系呢？！

yes4[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

300mA，50min 肯定转过了参考下别人文献上的试试（毕业论文上的条件很清楚）可以染一下胶和膜看看条件要慢慢摸索的希望楼主早点曝出条带

greenbee[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

汗一个！真心不好意思，我用的是半干转

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也一直在做小分子，比如caspase3（15kD）的WB，开始总是不出，但是这两次好了很多，总结经验就是：
1. 转膜液中不要加SDS
2. 转膜条件130mA 1h（不要超过1h）
3.最好使用0.22 PVDF
楼主可以试试，好运哦~~

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发表于 2013-5-13 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

u234[使用道具]
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发表于 2013-5-13 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前天做了一次，转膜液中不要加SDS了，转膜条件是200mA, 70min，使用的是0.22 PVDF膜，昨晚曝光，还是没有条带，哎，伤心欲绝啊！昨晚睡眠中朦朦胧胧浮现的，全是WB实验啊！
我想请教各位同仁，我做这个小分子量蛋白，每次条带都没有，但每次曝光，整张膜背景非常高，如果曝光时间5min,整张膜全部发光，非常亮，不知道大家是否知道这是什么原因啊！
期待大家的帮助！
先谢谢大家了！

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抗体不行？个人觉得western抗体因素应该是最主要的，看看你的抗体文献中有做出来的吗~
关于背景高，可能是封闭不够，或发光液过多，曝光时间过长导致
我发光通常都是在PE手套上，滴上发光液，把膜正面倒扣在发光液中，孵育1min左右，曝光时间一般不超过30s，目前对于绝大多数蛋白效果都挺好的~

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发表于 2013-5-13 16:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

抗体文献中是有做出来的。
我也曾用过PE手套的方法，但是发现如果曝光时间长一点的话，就会整个背景看到PE手套上的那种小点点，所以，后来就改用在干净、干燥的塑料10cm培养皿里曝光。
谢谢“龙葵军医”的热心帮助，希望如果有谁对小分子蛋白WB有经验的，多多给我指点，谢谢大家！

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