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标题:【求助】转膜后marker很淡

star#room[使用道具]
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发表于 2013-5-13 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】转膜后marker很淡


蛋白分子量在80-50间。10微升marker（thermo SM0671）上样，胶上marker挺清楚的。。。转膜用bio-Rad 湿转 120min，PVDF膜。。。转膜液含20％甲醇。转膜结束后膜上marker非常淡，几乎看不清。。。
请教WB高手，是不是转的时间太长了？这个分子量的转膜时间多长合适？
但是前后滤纸上我并没有看到marker的彩色条带啊。。。
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yonger[使用道具]
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发表于 2013-5-13 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜没转好，可能转过投了？或者转膜液没配好？预冷了吗
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发表于 2013-5-13 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很可能是转膜过了。建议4度100v恒压转90min就可以，还有就是marker可以上少一些，5ul足够了，marker也不便宜。
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发表于 2013-5-13 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实也有可能在转过了的情况下滤纸上没有条带的，这还是蛮正常的。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-5-13 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、可能是转膜buffer没配好，建议重新配制一下；
2、我们实验室转膜条件是200mA恒流90min-120min，我整张胶转过120min，大小marker都很清晰，所以我觉得120min可能不会导致转膜转过；
3、应该继续往下做，一抗二抗以后曝光看看，有时候marker很淡但蛋白条带很清晰，这种情况也是有的。
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发表于 2013-5-13 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

湿转120min，你用了好多电压哦，还有你用了什么膜，孔径大小？
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发表于 2013-5-13 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、可能是转膜buffer没配好，建议重新配制一下；
2、我们实验室转膜条件是200mA恒流90min-120min，我整张胶转过120min，大小marker都很清晰，所以我觉得120min可能不会导致转膜转过；
3、应该继续往下做，一抗二抗以后曝光看看，有时候marker很淡但蛋白条带很清晰，这种情况也是有的。

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你好，我用的是300mA 湿转 120min。。。PVDF膜 0.45um孔径。。。是不是电流太大了点
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ero11[使用道具]
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发表于 2013-5-13 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
湿转120min，你用了好多电压哦，还有你用了什么膜，孔径大小？

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恒流 300mA，转膜用0.45um PVDF膜
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star#room[使用道具]
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发表于 2013-5-13 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很可能是转膜过了。建议4度100v恒压转90min就可以，还有就是marker可以上少一些，5ul足够了，marker也不便宜。
谢谢！！

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之前试过marker上5uL的，但是跑出来的胶上颜色淡，怕转到膜上更看不清了，所以想把marker加量。。
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gogo[使用道具]
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发表于 2013-5-13 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前做过55kda的蛋白，湿转是用60V恒压2h，（低温进行哈，Bio-rad的湿转仪器里面有个降温的瓶子，叫什么我说不上）0.22um的PVDF膜，转膜后经常看不到Marker，但是往后做条带一般都能够出来，后来换成半干转20V 20min，0.22um的PVDF膜，彩虹Marker5ul，转膜后能够看到Marker条带，往后做也都能够做出来。还有一个重要的是PVDF膜使用之前要在甲醇过一下5-10秒钟哈。祝你好运
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