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标题:【讨论帖】western blotting试验技术讨论

ukonptp[使用道具]
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【讨论帖】western blotting试验技术讨论

to 各位群友:

麻烦大家就Western blotting实验原理、试剂准备、操作流程、注意事项、经验总结和各种疑难问题解答等内容进行讨论,谢谢。
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ukonptp[使用道具]
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2
 

我先来谈谈Western blotting 试验原理吧,算是抛砖引玉哦!!

蛋白免疫印迹(Western blotting、Western blot 或Immunoblotting)是先将组织样品通过电泳使不同分子量的蛋白质跑到一个横断面上,然后将蛋白质转移到膜上,再通过膜上蛋白抗原与一抗、标记二抗反应,最后用化学发光法检测,再用X胶片显影,拍照后量化,从而间接反映组织中蛋白含量。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛地应用于定量检测蛋白的表达水平。

简单技术路线流程:

组织样品制备——垂直电泳——转膜(和丽春红染色)——牛奶封闭——一抗孵育——二抗孵育——ECL化学发光——X胶片显影——拍照和用图像分析染件定量。
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ukonptp[使用道具]
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3
 

试剂准备:

1、组织样品制备:RIPA裂解液、PMSF;

2、灌胶:去离子水(可用三蒸水代替)、Acr/Bis、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、10%Ap和TEMED;

3、垂直电泳:4度电泳缓冲液、冰块、考马斯亮蓝及其洗脱液;

4、转膜:4度转移缓冲液、冰块、去离子水、自来水、丽春红染液、考马斯亮蓝及其洗脱液;

5、封闭:5%脱脂牛奶、DPBS;

6、抗体反应:一抗、二抗、抗体稀释液、5%脱脂牛奶、DPBS和PBST;

7、化学发光:ECL发光剂(A液和B液,分pg和fg级);

8、X胶片显影:显影液、定影液、自来水。
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ukonptp[使用道具]
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欢迎大家就Western blotting试验技术操作流程、注意事项、常见问题及其解答进行热烈交流,谢谢。
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mimili_901[使用道具]
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关于灌胶:
1.注意一定要将玻璃板洗净,最后用ddH2O冲洗,将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2.分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外),过滤后作为储存液避光存放于4℃,可至少存放1个月,临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡,有条件者可真空抽吸3分钟),加入10%AP(0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低,15%的分离胶可用到0.5:100)及TEMED(分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000,浓缩胶用0.8:1000)即可,如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。

3.封胶:
灌入2/3的分离胶后应立即封胶,胶浓度<10%时可用0.1%的SDS封,浓度>10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇,也可以用0.1%的SDS。封胶后切记,勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉,如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净,然后加少量0.1%的SDS,目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS,将玻璃板倒立放置片刻控净。

4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子,注意在拔除梳子时宜边加水边拔,以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶,随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正;若变形严重,可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样,长时间有利于胶结构的形成,因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

ps: 10%的AP最好现配现用,如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀,最好弃掉。
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finger[使用道具]
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我刚做不久,有一下几点体会:
1.根据目的蛋白分子量选择合适的实验条件:如分离胶的浓度,转膜的电压设置
2.抗体的优化:如果实验室没人用过,则新买的抗体一般要做预实验,摸索一下合适的稀释浓度
3.显影时曝光时间,由于对样品中目的蛋白浓度不是很清楚,为得到好的效果,一般需要做几个时间的片子,我们采用是2-3张底片叠一起曝光,最上面的底片就相当于曝光时间短。
4.封闭:一般用脱脂牛奶,但有人说抗羊抗体的话用FBS比较好
5.抗体分装,避免反复冻融
6.信号灵敏度:一抗可4度过夜,二抗则要2h即可。
大家指正
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fei1226com[使用道具]
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做了1个多月的WB,有几点体会:
1.玻璃板用两个星期左右可以泡次酸,这样很容易洗干净;
2.浓缩胶一定要等1小时左右再拔梳子,特别是现在天冷,凝得慢,急不得;
3.AP配置分装后-20度冻存,两周内使用都有效;
4.TEMED不是越高越好,提高用量胶是凝得快,但是胶很脆,易碎;
5..丽春红染色并不是金标准,有时候做小分子量的蛋白用丽春红染膜就不太明显,这时不要认为失败了,继续做下去,同样会有结果;
6.NC膜不用泡甲醇,泡甲醇的NC膜会出现皱缩的现象;(自己误操作)
7.一抗37度过夜也能出条带,且有非特异性的条带出现;这个现象自己不清楚原因,此后都是按照标准的4度过夜。思考,如果说在37度的条件下抗体更容易结合,那么孵一抗的时间可以适当缩短。
8.用脱脂奶粉的封闭液一定要现用现配。
大家多多交流
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关于显示:个人认为用碱性磷酸酶系统显示更直观,更好控制,更简单方便。
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那我就谈谈试验中要注意的一些问题

一、样品的处理
1、若蛋白需保持活性,那么全部操作需在冰上进行,并且在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,防止蛋白降解。
2、如果需要检测磷酸化的蛋白,那么裂解液中必须加入磷酸酶抑制剂。
3、样本定量时注意选择受buffer成分影响的方法,或者尽量降低溶剂成分对定量结果的干扰,以保证蛋白定量的准确。
4、样本如果需长期保存,可以放于-80度冰箱中,切记反复冻融。
5、样本上样需适宜,过少会检测不到所需要的蛋白,过多可能导致背景升高。
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二、蛋白分离
1、分离胶不要倒得太满,需要有一定浓缩胶的空间,否则起不到浓缩效果。
2、PAGE胶在0.5-1h内凝聚最好,过快表示TEMED、APS用量过多,胶太硬易龟裂;太慢则说明两种试剂用量不够或系统试剂不纯或者失效。
3、混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合,太慢不均匀,都能导致电泳带畸形。
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