【求助】western blot 条带极其微弱？

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标题:【求助】western blot 条带极其微弱？

baidukk[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是Akt。包括总蛋白以及磷酸化蛋白，抗体是CST的
结果出来的条带都非常的微弱，包括CST的阳性对照样品，出来的条带背景极其深，条带很难看清楚，而且很微弱

我加的蛋白已经加到80ug以上了，actin很浓黑，可目标蛋白就是出不来
半干转，恒压20V，60min。膜用丽春红染过，蛋白能转上去的。

求救啊····会不会抗体有问题啊？？效价不够？？说明书上是1：1000，我做到1：500也是差不多

applebook=213[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、做的是组织还是细胞？
2、上样达到80ug，可能已超过胶孔的承载力，可以减少上样量
3、半干法转膜一般采用横流转膜，5.5*8.5cm的膜电流约60mA
4、封闭用的是BSA还是奶粉？
5、抗体的货号，发个图上来

baidukk[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、做的是组织还是细胞？
2、上样达到80ug，可能已超过胶孔的承载力，可以减少上样量
3、半干法转膜一般采用横流转膜，5.5*8.5cm的膜电流约60mA
4、封闭用的是BSA还是奶粉？
5、抗体的货号，发个图上来

=====================================================

细胞的蛋白，之前也是从30ug左右的蛋白开始做，但是也做不出来
封闭我用的是奶粉
抗体是CST的。货号分别是p-Akt（9271）p-p70S6（9206）....
这个是p-p70S6

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2013-5-14 17:28

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baidukk[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个是p-Akt

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2013-5-14 17:28

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发表于 2013-5-14 17:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个是ACTIN.

做了一个月了，还没有出来，求救啊····

附件

2013-5-14 17:29

62731191.jpg (17.32 KB)

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发表于 2013-5-14 17:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的裂解液里加了磷酸化酶抑制剂了吗

baidukk[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的裂解液里加了磷酸化酶抑制剂了吗

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加了，罗氏的cocktail

lixi559[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我说的磷酸化酶抑制剂氟化钠和钒酸钠，罗氏的cocktail没用过，我们做P-AKT做的非常多，AKT是非常好报的的指标，只要提的蛋白没问题，都能跑出来

baidukk[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我说的磷酸化酶抑制剂氟化钠和钒酸钠，罗氏的cocktail没用过，我们做P-AKT做的非常多，AKT是非常好报的的指标，只要提的蛋白没问题，都能跑出来

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这两个都是有的。。。我做总的AKT条带也不强，而且不稳定。请问这位战友，提蛋白的过程中有什么要注意的么？谢谢

lixi559[使用道具]
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发表于 2013-5-14 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能是抗体的问题，你是哪里的，要是方便的话我可以借你点抗体用用

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