小中大最近用western做AKT磷酸化的一些试验，前两次曝光后还能看到磷酸化的akt条带，但是这两次，是什么都看不到了，该出现条带的位置，什么信号都没有了！
我的大概步骤如下：
（1）大鼠冰冷PBS灌注后取脑组织，先放入冰冷PBS中，取皮层组织放在EP管内；
（2）迅速转移如-80度冰箱内，一周内提取蛋白；
（3）提取蛋白：将蛋白放在碎冰上解冻；
（4）同时准备RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂；
（5）脑组织放入玻璃匀浆器内匀浆，也是低温操作；
（6）12000转离心，并取上清；
（7）蛋白定量；
（8）与上样缓冲液混合，煮沸10分钟，冷却后-20度冻存；
（9）电泳、转膜；
（10）常温封闭1小时，一抗4度过夜（1：1000稀释）；
（11）洗膜后二抗1小时，再次洗膜；
（12）曝光
结果是actin条带非常清楚，而磷酸化的akt一点信号没有！漆黑一片！
可能步骤写的也不够详细，各位老师看看我哪些步骤有失误，哪些需要改进？
或者是根据你们的经验，从蛋白提取到曝光，哪些步骤需要特别注意，最有可能哪里出现问题呢？
谢谢大家！
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既然前两次能出来的话,实验方法倒不需要改进,应该属于某种操作错误.或试剂的PH变了之类的.
重新double check 是否试剂之类的都没有问题,有嫌疑的就重新配吧,特别是tris-hcl之类的.
然后再做一次看看.
