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标题:【求助】akt跑出来了，但是p-akt跑不出来总也跑不出来

30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-5-16 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】akt跑出来了，但是p-akt跑不出来总也跑不出来


相关疾病：
主动脉瘤
各位大仙，求帮忙看看，我到底是哪里有问题，我的akt跑出来了，但是p-akt就是跑不出来。最近快郁闷死了。
我做的是大鼠腹主动脉瘤组织中p-akt的WB检测
方法如下：
1、取组织。组织取出后用生理盐水冲洗一下，放入-80度冰箱保存。待同一批组织陆续取完后再一起拿出来裂解。
2、裂解。ripa裂解液：组织的体积比=3：1，裂解液用之前加入PMSF。裂解30分钟。
3、蛋白变性。
4、电泳：80v积层胶，130v分离胶。
5、转膜：230mA，1.5小时
6、封闭：BSA封闭1小时。
7、一抗：BSA稀释，室温（约27°），摇床晃3小时
8、二抗：TBST稀释，4°过夜
9、洗膜：10分钟，3次。
10、显影：ECL显影。
大家帮帮忙啊，我的p-akt什么都没有，很干净，到底是什么原因呢，求各路神仙帮忙解决下问题。
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发表于 2013-5-16 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加磷酸化蛋白酶抑制剂没有啊？
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发表于 2013-5-16 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很干净，就表示抗体不给力。 提高一抗浓度。
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发表于 2013-5-16 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加磷酸化蛋白酶抑制剂没有啊？

===========================================================================================================

买的碧云天的ripa，说明书里面说有加磷酸酶抑制剂，并且实验室其它同学也有做的，也是用的那种裂解液，没有另外再加磷酸酶抑制剂，但是他做出来了。
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发表于 2013-5-16 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很干净，就表示抗体不给力。 提高一抗浓度。

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哦，CST的一抗，说明书上给的推荐剂量是1:2000，我的浓度是1:1000，还需要不需要再把浓度弄高点呢？
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发表于 2013-5-16 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们刚做了P-AKT，跟你们都是CST的一抗，1:2000稀释，4°过夜，做出来了
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发表于 2013-5-16 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
白血病

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我们刚做了P-AKT，跟你们都是CST的一抗，1:2000稀释，4°过夜，做出来了

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请问你是做组织还是细胞的啊，我要做白血病细胞的，最近在订抗体，也准备订CST的，可否告知你用的是哪个编号的啊,我最近抗文献有人一抗1:1000稀释呢
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发表于 2013-5-16 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也做的细胞的，我们的稀释直接按照CST给的浓度进行的。不好意思，因为一些原因，编号暂时无法提供给你，
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发表于 2013-5-16 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Akt的pT-308, 还是pS-470?
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-5-16 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 abc816 于 2013-5-16 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Akt的pT-308, 还是pS-470?

您好，我的抗体是akt的ps-473
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