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标题:【分享帖】秀出你的western转膜条件

woshiduiyan[使用道具]
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发表于 2013-5-16 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】秀出你的western转膜条件


除了抗体原因，转膜是怕是western成败的最关键因素。
看到园子里好多好多人在求助转膜时间，园子为何总结出一系列分子量蛋白转膜的时间呢？少说这对于大多数新手来说，是极好的礼物，说大点，借助丁香园的强势人气，此举可以提高我国一线科研人员WB水平也未必。我认为不用摸转摸条件的话,WB的效率提高数倍不成问题。

请大家多多提供一线转膜经验
也请园子里管事的兄弟姐妹多思量，我希望可以发起一个全园子的征集计划，由本板块版主负责筛选归纳。

[ 本帖最后由 woshiduiyan 于 2013-5-16 17:39 编辑 ]
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-5-16 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对这个方向不大熟悉，但我想应该包括下列几个方面，请战友们费心了，谢谢。

蛋白来源：
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：
WB用膜类型、孔径：
转膜方式（恒压、恒流）：
转膜时间：
转膜设备:
转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等）

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2013-5-16 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源： 肌肉细胞膜
蛋白名称（可保密）： ***
蛋白分子量： 50--80 kDa
WB用膜类型、孔径： NC膜/PVDF膜(本次试验的结果选用的是NC膜)
转膜方式（恒压、恒流）： 半干转 恒流50mA
转膜时间： 70 min

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：
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发表于 2013-5-16 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白来源：RAW264.7 总蛋白
蛋白名称（可保密）：一些转录因子
蛋白分子量：40~70KD
WB用膜类型、孔径：0.45 NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流400mA
转膜时间：60~90min

PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要
曾经因为失误，转了15min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别
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发表于 2013-5-16 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：内皮细胞 总蛋白
蛋白名称（可保密）：occludin & AKT
蛋白分子量：65KD & 56KD
WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压 100V
转膜时间：60~70min
同意“ycwzq”所说的“除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要”。
鉴于“wcm123_1980”版主所提的意见，我把目的蛋白名字也秀出来了，设备名字是“Bio-Rad mini”。
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发表于 2013-5-16 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织 总蛋白和核蛋白
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：65KD & 55KD
WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）
转膜方式（恒压、恒流）：半干转 恒压 12V
转膜时间：30-40min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转；
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发表于 2013-5-16 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：293T细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：95KD & 35KD
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压 90V-110V,控制电流不要超过300mA。
转膜时间：70min
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发表于 2013-5-16 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
肿瘤
蛋白来源：肿瘤手术标本
蛋白名称（可保密）：转录因子
蛋白分子量：33KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：350mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

说明：相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；
实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
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eric930[使用道具]
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 小中大

蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可保密）：smad3
蛋白分子量：54KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：350mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
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IAM007[使用道具]
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发表于 2013-5-16 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白来源：胰腺癌细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：16KDa and 42KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：120V 恒压
转膜时间：90 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
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