蛋白质与蛋白组学

楼主所说的问题其实在很多生物化学类的技术书籍上都有相关的解释， 这里我把我所了解的一些原理和楼主分享一下。
不连续电泳是指包含两种以上的缓冲溶液， pH 和凝胶孔径的电泳。因此制备凝胶时，需分别制备分离胶及浓缩胶，多用于分析浓度较稀的样品。这里我们用常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳为例和楼主分析下大孔胶和小孔胶的作用。

不连续电泳之所以有很高的分辨率是因为有 3 种效应：即浓缩效应、电荷效荷和分子筛效应。

1. 浓缩效应：样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，甚至有的能浓缩几百倍。为什么样品会在浓缩胶中被压挤成层呢 ? 这是因为样品胶和浓缩胶是用 pH6.7 的 Tris – HCl 缓冲液制成；电泳时，由于 HCI 解离度大，几乎全部释放出 Cl – ；而在电泳槽中的 Tris –甘氨酸缓冲液是 pH8.3 ，因为甘氨酸的等电点为 6.0 ，在电泳过程中，它只有极少数分子解离成NH2CH2COO- 。一般酸性蛋白质在此 pH 值下也解离为带负电荷的离子，但其解离度比 HCl 小，比甘氨酸大。这 3 种离子带有同性电荷，在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的，而且它们的有效泳动率快慢是按下列次序排列的，即： Cl – ＞蛋白质＞甘氨酸。 电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面（见附图 ）。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。

2. 电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。

3. 分子筛效应：当蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于 pH 和凝胶孔径突然改变（选择分离胶的 pH 为 8.9 ），使甘氨酸的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加，此时甘氨酸很快就赶上并超过了蛋白质分子，这样高电势梯度不存在了，使蛋白质样品进入一个均一的电势梯度和 pH 条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，相对分子质量或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛作用。即使净电荷相似，泳动率相等的蛋白质分子也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。

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楼上这里讲得很清楚啊，受益了，以前想的很简单，以为就是电流及分子筛的作用，原来设计得如此巧妙。浓缩胶pH6.7 分离胶pH8.9 用Tris-HCl配浓缩胶，缓冲液用Gly来配置 这些都是有讲究的啊。