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标题:【讨论帖】western blot 条带形状讨论

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发表于 2013-5-18 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】western blot 条带形状讨论


做western blot 近一年，在要发文章的时候发现条带不够漂亮，高表达蛋白有时是哑铃状，有时是笑脸状，做内源性蛋白时同一蛋白会出现条带不在同一水平线上，或者同一条带只显影一部分或者不同实验鼠个体组织的β-actin有的条带缺失，做co-ip时拉下来的条带比较弥散，位置上移10-20KD左右。

这些现象有谁遇到并解决了，或者谁知道其中的原理，谢谢一起分享，共同进步共同发财。

本人是中南大学湘雅医学院的一名技术员。

配试剂配胶方案：见附件 跑胶：80v，30min；120v，70min（8% 常规）转膜：290mA，90min 冰浴
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发表于 2013-5-18 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶要混匀……
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发表于 2013-5-18 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于发财的问题我也在想，目前最起码做出好图，发高质量的paper国家还是愿意给钱让你完成研究工程进展。

诚心向各位学习，希望高人点化精华贴，谢谢！
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-5-18 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
（1）带型不漂亮主要原因可能是你跑胶的速度太快了，欲速则不达，我一般40 v， 1h, 然后80v跑完。这样带型一般比较漂亮。另外，Page胶制备时一定要充分混匀，如果胶不均匀条带也不会漂亮；条带粗的蛋白也适当降低蛋白上样量，一抗和二抗的比较适当降低。

（2）条带来时缺一块，可能是由于你的一抗孵育时间太短了，我一般是4度过夜，而不是室温1-2h,这样抗体才能与蛋白带充分接触。
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发表于 2013-5-18 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、制胶时胶没混匀，导致凝胶不均匀，胶混匀时按一个方向缓慢搅动就可以，还有就是制胶时候的温度不要太高，最好是25°C左

右，另外就是上样的时候要充分混匀，

2、多加点蛋白酶抑制剂

3、孵育抗体一定要让抗体均匀的接触膜的表面，最好是4°C过夜，

4、一抗的浓度可能还有点高了，摸索一抗最佳浓度。
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发表于 2013-5-18 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助求助，我最近两次做的WB，上胶跑得非常非常慢！

跑胶条件是上胶10mA/胶，下胶100v（条件是原来的实验室摸索过的），一直做得好好的，但是不知为什么这两次上胶居然要跑3-4h！！原来几十分钟就可以的……TAT

配胶的东西应该没问题，因为下胶时间正常，上下胶用的不同东西就是tris-hcl，上胶用的PH6.8，下胶用的ph8.8，两种各配了100ml，一直用着的。

电泳液配的10×（配的时间大概有2周了），不用回收电泳液。

有哪位知道是哪里出了问题么？？
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发表于 2013-5-18 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有可能是膜的原因，看看你要的目的蛋白是多大的，要是比较小的话，强烈建议用PVDF膜，之前我也出现过这种情况，换了膜之后就好了。
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发表于 2013-5-18 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助求助，我最近两次做的WB，上胶跑得非常非常慢！

跑胶条件是上胶10mA/胶，下胶100v（条件是原来的实验室摸索过的），一直做得好好的，但是不知为什么这两次上胶居然要跑3-4h！！原来几十分钟就可以的……TAT

配胶的东西应该没问题，因为下胶时间正常，上下胶用的不同东西就是tris-hcl，上胶用的PH6.8，下胶用的ph8.8，两种各配了100ml，一直用着的。

电泳液配的10×（配的时间大概有2周了），不用回收电泳液。

有哪位知道是哪里出了问题么？？

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是不是 上层胶没加SDS？

在此本帖主谢谢大家积极参与讨论！
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89tongzijun[使用道具]
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 小中大
有可能是膜的原因，看看你要的目的蛋白是多大的，要是比较小的话，强烈建议用PVDF膜，之前我也出现过这种情况，换了膜之后就好了。

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谢谢经验分享，我们一直都是用millipore PVDF膜，应该不是这个原因。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-5-18 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜时候没转好，也有可能的。转完膜后拿丽春红染一下，看看转膜效果
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