【求助】6His蛋白纯化同样是不挂柱啊！

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】6His蛋白纯化同样是不挂柱啊！

20 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】6His蛋白纯化同样是不挂柱啊！

红茶可乐[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76911
精华 0
积分 188
帖子 116
信誉分 100
可用分 1341
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2013-5-18 14:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友！我已经做纯化三个月了还没出来！觉得快绝望了！我纯化6his蛋白，用过INvetrogen的Ni离子用过Clontech的Co离子，也用过pH8.0，7.0,6.8的Buffer，可是一直挂不上，就是比较原液和树脂结合过的蛋白液，目的条带一点也没减少！我们这里没有高压液相色谱啥的，靠重力流穿，老板说不太可能是His卷进去了，所以怀疑树脂不够好，大家给点意见，用什么公司的树脂好呀？

moonlight45[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 79769
精华 0
积分 487
帖子 654
信誉分 100
可用分 4096
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态离线

发表于 2013-5-18 14:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也用镍柱纯化6His蛋白，遇到类似的问题，但我的情况不是完全不挂柱，上柱前和孵育后流穿的样品比较，蛋白还是少了的，但是——洗脱组分跑出来几乎没有蛋白条带，即使有淡淡的条带，也是杂带。这个问题很困扰，不知道是不是上清中目的蛋白太少了？

biabiade[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76440
精华 0
积分 388
帖子 435
信誉分 100
可用分 3036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2013-5-18 14:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、在确认柱子没问题的情况下，建议做个WB检测一下His tag，可能由于某些原因该亲和标签
断掉了而造成不挂柱的。
2、若可以检测得His tag，那么就有可能与蛋白质的结构有关，标签被“包埋”而暴露不出来
了，这样自然也是无法挂柱的。可以尝试一下把该标签构建于该蛋白质的另外一端，比如
原来是在N端的，改为在C端；同时也可以把该蛋白变性后再过柱，一般就是可以挂柱的。
3、另外请确认一下层析buffer，别搞错了平衡液和洗脱液，同时再确认一下洗脱液的配方是否
正确，如果使用咪唑进行洗脱的，其浓度是否足够了，一般最高用到500mM。

用重力过柱的方法可取的，没有问题；上清中目的蛋白的多少对与柱子的结合影响应该不会
很大，但是会影响你SDS-PAGE的结果，若是其蛋白量太少，用SDS-PAGE可能检测不到，建议同
时做个WB比较一下。

红茶可乐[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76911
精华 0
积分 188
帖子 116
信誉分 100
可用分 1341
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2013-5-18 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家，我WB是已经检验过的，我打算下一步，先管别人要一点已经确定能做出来的6his蛋白，用我的树脂和buffer来做，如果说还是不出来，就说明树脂的问题，如果做出来了，就是我的蛋白的问题，或者Buffer条件不适合我的蛋白，这样我就放弃his尾，改用离子交换，胶滤等非特异的方法，我是这样想的，不知道对不对，现在很不自信！

红茶可乐[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76911
精华 0
积分 188
帖子 116
信誉分 100
可用分 1341
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2013-5-18 14:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于蛋白不挂柱是身有体会，首先确定你的蛋白是否有6His标签，我以前做的一个蛋白就是误以为有6His浪费了几个月时间，上样缓冲液一般Tris，NaCl，pH值最好不要低于7，pH高可以增加蛋白与Ni的吸附力的，
另外上样的话要流速要慢一点，Ni柱用了几次就要再生的，从Ni柱颜色变化可以知道柱上Ni的减少，用久了颜色变淡。

tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态离线

发表于 2013-5-18 14:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是做6XHis蛋白的，一开始挂不上，怎么也挂不上
后来直接把胶扔进蛋白里，让它们结合半个小时
再把胶灌进柱子，用高浓度咪唑洗脱，结果那个条带好粗的啊！
结合时间太短也许是个问题……
重力流速或者放慢流速都不行的时候，将蛋白加入柱子然后保持十几分钟再放出来
试试这样如何？

ending[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2013-5-18 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是做6XHis蛋白的，一开始挂不上，怎么也挂不上
后来直接把胶扔进蛋白里，让它们结合半个小时
再把胶灌进柱子，用高浓度咪唑洗脱，结果那个条带好粗的啊！
结合时间太短也许是个问题……
重力流速或者放慢流速都不行的时候，将蛋白加入柱子然后保持十几分钟再放出来
试试这样如何？

==========================================================================================

请问你所用的高浓度咪唑是多大浓度呢？我用说明书推荐浓度250mM，一直洗脱不出来。也不知道是没挂上还是没洗下来

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态离线

发表于 2013-5-18 14:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

洗脱一般有两种方式，一是采用竞争试剂，如咪唑（0~0.5M）、组氨酸（0~0.05M）、氯化铵（0~2M）等将蛋白质从柱子上置换下来；二是减小pH值，洗脱目标蛋白，大多数蛋白质在pH 4~6的范围内可被洗下来。用竞争试剂咪唑或减小pH值的方法洗脱蛋白质，金属离子仍结合在柱子上；若用竞争试剂组氨酸或氯化铵洗脱蛋白质，会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来。洗脱缓冲液中必须加入0.15~1.0 M NaCl以消除离子交换作用。梯度洗脱最好在起始平衡液的恒定pH下进行，可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱。

xueyouzhang[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76770
精华 0
积分 470
帖子 640
信誉分 100
可用分 3996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态离线

发表于 2013-5-18 14:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问你所用的高浓度咪唑是多大浓度呢？我用说明书推荐浓度250mM，一直洗脱不出来。也不知道是没挂上还是没洗下来

==========================================================================================================

我一开始用的400mM的咪唑，我的蛋白上有两个his标签（原载体上一个，构建的蛋白上一个）
后来改用500mM的咪唑洗脱，洗脱比较彻底。大概三到四个柱体积的咪唑就可以洗脱了。
昨天刚跑的胶，还没有拍照，等我拍了照片贴上来再说。
图片来了
这是我纯化的两个蛋白
1：8M尿素溶解后，纯化前
2：穿出液
3：洗脱液

纯化蛋白A的Ni-NTA凝胶体积太小，没有把所有目的蛋白都结合上，所以穿出液里面的目的蛋白量比较大。把穿出液再次过柱就基本没有不能结合的目的蛋白了。

蛋白B上有两个His标签，因此洗脱比较难

附件

2013-5-18 14:54

79181609.snap.jpg (22.89 KB)

tianmei001[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73832
精华 1
积分 585
帖子 806
信誉分 102
可用分 4823
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-28
状态离线

发表于 2013-5-18 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相似的问题我也遇到过：
1）目的蛋白和His标签的表达都检测检，您已经用Western检测过，应该说没有问题的；
2）考虑缓冲液的PH值，这个也有很多人论述了；
3）在后续试验条件允许的情况下，使用尿素来代替咪唑作为变性剂，使蛋白充分的展开，让His完全展露出来。曾经也有师弟做过，用咪唑浓度已经加挺大了，可就是无法挂柱，可换上尿素就解决了，但是需要后续的复性。

20 1/2 1 2 ››