【求助】新手做WB的几张片子，请各位高人指点

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标题:【求助】新手做WB的几张片子，请各位高人指点

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是一个门外汉，刚刚做WB。做出来后全是模糊的片子，还有就是只有黑点，没有条带。一直没找到原因。恳请各位高人教导。并且按照以下的方法做。我做的是SD大鼠骨骼肌组织的蛋白检测，取300mg肌肉，最终加2.4ML裂解液。10000转离心10分钟。定蛋白也是按一下方法。上样按每10微升80微克蛋白上的样。用的是大连竞迈公司的垂直电泳仪。装模是半干法，按没分钟1KD转的。一抗1：1000.二抗1：6000。。我测的蛋白在95KD左右，一半装2-2.5小时。但是结果不是背景强就是没东西。而且经常有黑点。
方法4 免疫印迹

1样品制备和蛋白定量

1.1 容液配制

10ml100mmol/L PMSF:0.1742g溶于10ml的异丙醇中,至与4?C保存。

50ml 5mol/L NaCl:14.61g溶于40ml三蒸水中，定容至50ml。

100ml 20% SDS:20g溶于80ml水中，加热溶解，定容至100ml。

100ml 1mol/LTris-HCl: 12.114g溶于80ml三蒸水中，定容至100ml。

配RIPA裂解液：

RIPA

终浓度

总体积（500ml）

5mol/L NaCl

0.15mol/L

15ml

TritonX-100

1%

5ml

Deoxycholow

1%

5g

20%SDS

0.10%

2.5ml

1mol/LTris-Hcl(Ph=7.4)

10mmol/L

5ml

加三蒸水定容至500ml，使用前加PMSF至1%。

1.2 蛋白提取（此步在冰上进行）

组织称重，切碎，以每克组织加3ml RIPA裂解液，冰上以匀浆器匀浆，转到小离心管中，冰上放置40分钟，使其蛋白质充分裂解。4?C ，10000rpm，离心10min，取上清，转入小tube管中，-20 ℃贮存备用。

1.3 蛋白定量

Bradford 法定蛋白的原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

考马斯亮蓝G-250染液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

采用Bradfold法进行蛋白定量，以1 mg/mlBSA 制作标准曲线。

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，配1mg/ml BSA(1mg BSA溶于1ml三蒸水)，按下表配置梯度浓度的标准溶液。

浓度

0mg/ml

0.1mg/ml

0.2mg/ml

0.4mg/ml

0.6mg/ml

0.8mg/ml

1mg/ml

1mg/ml BSA

0ul

10ul

20 ul

40ul

60ul

80ul

100ul

1×PBS

100ul

90ul

80ul

60ul

40ul

20ul

0ul

其次，将以上浓度的标准溶液依次加入96孔板中，每孔加40ul，制作平行孔。之后，将样品上清液用1×PBS稀释50倍（或100倍），混匀，以每孔40ul加入上述96孔板中，制作平行孔。

根据不同浓度BSA在595 nm的不同的紫外光吸光值，用酶标仪测定样品在595 nm处的吸光值，用excel求出一元线性回归方程（y=kx+b），其中y是吸光值，x是测定的样品上清液的浓度，求出样品浓度（x值（ug/ul））。

酶标仪设定参数：

MODE:END POINT;

WELL:96;

FILTER(波长): 596nm;

振荡速度：MEDIUM;

振荡时间：2min

2 SDS-PAGE

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2.1主要试剂配制

30% 电泳凝胶：丙烯酰胺29.2 g，N, N-亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，加三蒸水溶解，定容至100 ml，过滤后4℃备用。

20% SDS： 20 gSDS，加三蒸水溶解，定容至100 ml。

浓缩胶缓冲液：Tris-Base 30.25 g，20% SDS 10 ml，加三蒸水60 ml，饱和盐酸调pH 至6.8，定容至500 ml，4℃备用。

分离胶缓冲液：Tris-Base 90.5 g，20% SDS 10 ml，加三蒸水约60 ml，饱和盐酸调pH至8.8，定容至500 ml，4℃备用。

10×电泳缓冲液：29gTris-Base，144g Glycine，10 g SDS加500 ml三蒸水溶解，震荡混匀后，定容至1000 ml，4?C 备用，用时稀释至1倍。

4×样品缓冲液：1.5MTris-HCl(pH 6.8)166 ul，20% SDS 400 ul，400 ul 甘油，0.062g二硫苏糖醇，0.005 g溴酚蓝，定容至1 ml，-20℃备用。

1×磷酸盐缓冲液（PBS）：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，加800 ml三蒸水，振荡混匀后，用饱和盐酸调pH至7.8，定容至1000 ml。

10%过硫酸胺：0.2g溶于2ml三蒸水中，隔一周配一次，避光4℃放置。

脱色液：500 ml甲醇，100 ml冰醋酸，加三蒸水至1000 ml。

考马斯亮蓝染液（R-250）：2.5 g考马斯亮蓝R-250溶于500 ml 脱色液中。

2.2 制胶

用夹子夹好垂直电泳板，固定在电泳架上，先用蒸馏水检测一下是否漏水，将梳子放入玻璃板中，在距梳子的下缘1.5-2cm（浓缩胶的宽度）的地方画一条线；之后按下列配方配制分离胶，混匀，用20ml注射器注入电泳板缝，加之线的高度即可（分离胶的宽度）中，立即用酒精压平分离胶的上平面，使其成为一条线。约1小时待其凝固后，制备浓缩胶，移入玻璃板中，立即将梳子放入浓缩胶中，凝固0.5小时。

表一12%分离胶的配方

分离胶(12%)

浓缩胶（4%）

三蒸水

3.5 ml

2.25 ml

缓冲液

2.5 ml

1 ml

30%电泳凝胶

4 ml

0.5 ml

10%过硫酸铵

75 μl

30 ul

TEMED

10 μl

10 ul

woshituzhu[使用道具]
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小中大

2.3制样

每孔加样50-100 μg蛋白质，根据样品上清液浓度，计算每孔中蛋白质样品的体积，补1×PBS使体积为15μl，再向每个样品管中加5 μl 4×样品缓冲液，一切操作均在冰上进行。混匀后沸水浴3-5分钟，-20?C备用。

2.4上样、电泳

将制好的胶放在电泳槽中，加满电泳缓冲液，轻轻拔掉梳子，用微量进样器加入处理好的蛋白质样品，左侧第一个孔道为蛋白Marker，依次在各个孔道中加入样品，并做好顺序记录。安装好系统后，4?C、220V电压下开始电泳，使蛋白质样品首先在浓缩胶中压缩成一条细带，然后继续电泳，直至样品指示剂-溴酚蓝到达玻璃板的下缘，关掉电源，取下制胶板，用刀片或镊子将两块玻璃板轻轻撬开，用单面刀片将浓缩胶切掉，将分离胶左上方切掉一个小角以标记样品顺序。（由于分离胶非常容易断裂，因此在移动前手需要保持湿润，也可在胶上滴加一些三蒸水。）

3 Western Blot

原理：蛋白质样本和生物素标记的蛋白marker标准经SDS-PAGE后转于印迹膜上，然后经一抗→HRP 标记的二抗→HRP催化LumiGLO试剂发生反应并产生荧光→显影于X-光片上。其基本原理如下图：

3.1 主要试剂配制

10×转移缓冲液(transfer buffer)：30.3 gTris-Base，144.1 g Glycine，500 ml三蒸水，振荡混匀后，定容至1000 ml，4℃备用。用时用0.1 M磷酸缓冲液即1×PBS和甲醇稀释至1倍，使甲醇的终浓度为20%（V/V），4?C备用。

PBST缓冲液： 1×PBS加Tween20，使Tween20的浓度为0.1%。

封闭剂（5%脱脂奶粉）：2g脱脂奶粉，40 ml PBST缓冲液，振荡混匀，4℃备用，可重复使用1次。

转移平衡液：10ml 10×transfer buffer，20ml甲醇，70ml 三蒸水，振荡混匀。

3.2 转移

准备与胶同样大小的PVDF膜，和相同大小的8层滤纸。

3.2.1平衡

先将PVDF膜放在甲醇中平衡1分钟后（如果硝酸纤维素膜则不需要在甲醇中平衡1分钟），再放到1×的转移平衡液中平衡5分钟。将8层滤纸放在1×的转移平衡液中平衡5分钟。将电泳后的分离胶放到三蒸水中平衡1-5分钟（时间尽量短）。

3.2.2转膜

转膜仪的下面是阳极，依次放置已经在转移平衡液中平衡过的（顺序由下至上）4层滤纸、PVDF膜、电泳凝胶、4层滤纸（每放置一层需要用玻璃棒赶尽气泡，用滤纸将周围的液体吸干，注意千万不能将胶小于滤纸，否则将会导致短路）。在PVDF膜的左上角用铅笔标记样品顺序。在转移夹层的顶部放置阴极电极。接通电源，室温、220V转移25-30分钟。转移后的凝胶放到考马斯亮蓝R-250中染色，无明显条带显示表明转移效果较满意。

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3.3 封闭

在25℃条件下，PVDF膜放入封闭液中（封闭好，以防液体挥发），以每分钟60转恒温摇床上振荡60分钟。

3.4 一抗结合

依据抗体说明书的有效浓度，使用PBST和封闭液（1：1）来配置一抗，混合均匀。（例如膜为4×7.5cm2，配制4ml GAP-43(1:400)：2ml封闭液+2mlPBST+10ul抗体）

将PVDF膜放在一抗中。4?C孵育过夜（抗体的体积至少要覆盖膜表面，防止干燥。）。一抗可回收再次使用（如连续使用放置4?C，否则放置-20?C）。

洗去一抗：25℃条件下，摇床转速为75转/分钟，用PBST洗膜3次，每次在恒温摇床上振荡10分钟。

3.5 二抗结合

加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠IgG (1:3000，制备时封闭液和PBST的比例为1:1)，37℃，60转/分钟，在恒温摇床上振荡60分钟。

洗去二抗：25℃条件下，摇床转速为75转/分钟，用PBST洗膜3次，每次在恒温摇床上振荡10分钟。之后用PBS洗膜10分钟。

3.6 ECL显色

利用化学发光的原理，ECL Western印迹系统使得快速高灵敏度检测蛋白成为可能。在ECL Western印迹系统中，目的蛋白是通过辣根过氧化物酶偶联的抗体进行检测，检测反应的底物Lnminol在辣根过氧化物酶的作用下发生氧化化学发光反应，所发光在增强剂作用下，强度提高了1000倍，用感光胶片记录发光的位置和强度。

在平底容器（如香皂盒）中等体积加ECL试剂盒中1溶液和2溶液，混匀（注意避免光线直射）。PVDF膜放入平底容器中，将混匀好好的ECL溶液加到PVDF膜上，使液体和膜充分接触，轻摇5分钟。取出膜，吸干多余液体，然后将PVDF膜放在保鲜膜上包好（蛋白质面朝上），用玻璃棒赶尽所有的气泡和褶皱，放入暗盒中，剩下操作在暗室中进行。暗室对X射线胶片分别曝光30秒，1分钟，3分钟，5分钟，胶片放入显影夜3-5分钟，之后放入定影夜1-3分钟，自来水冲洗，晾干后观察，计算机定量扫描处理。

附件

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17597308.snap.jpg (62.54 KB)

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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转完的膜上有胶残留吗？如果没有的话，证明一抗不大好。
看了一下，你的背景深的图片上有条带的，但是也有杂带，可能是一抗抗体不是很好，也有可能是封闭不够。
如果目的条带可能看出来，且周围杂带较少，结果也还可以用的。
同时，也建议你延长下封闭时间。封闭的牛奶就不用回收了，也不贵，牛奶放久了容易坏。转膜我一般用100v，90min。
一抗你可以试下4度过夜。
二抗就室温一小时。
我是这么做的，希望能帮到你。

abc816[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一抗特异性不高，或封闭时间短，可适度延长！

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上两位，我封闭一小时，用的是脱脂奶粉配的封闭液，抗体是多克隆的SANTA的抗体。转膜仪是固定电流的那种，上面显示输出电流是30毫安。封闭液都是用的新鲜的，没回收利用过。一抗一直是4度过夜。二抗是室温一个半小时、
上面第三张片子的一抗是用的Proteintech公司的。不知道问什么会出现黑点，而且中间是白版。以前也总会出现这样的问题，不知道怎么回事啊。

jkobn[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多抗的话，一般效果和你上面两张差不多。后面的几张最有可能是抗体效果不好，建议联系试剂公司投诉，santa的可以换一只，黑点是抗体没纯化好的问题。

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-5-18 15:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两个问题：

1、一抗用 western blot验证了吗？
2、如果验证，并用了最适浓度，那就是没洗干净。

应该重点考察这两项。

===========================================================================================================

一抗怎么验证啊？不好意思，新手刚做，还不知道怎么回事呢，

关于最适浓度，试过1：500 ，1000，2000的三种浓度，基本都是这样啊，只是1;500的背景很黑，就像上面一样啊，至于1：1000的虽然背景不怎么暗，但是黑点还是有的，就像上面做的那张空片自一样啊，中间白板，四周是黑点。

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