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标题:【求助】请大家帮忙分析这张双向电泳胶的缺陷及...

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发表于 2013-5-18 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请大家帮忙分析这张双向电泳胶的缺陷及...


第一次跑胶(血清),结果如下,请大家帮忙分析这张双向电泳胶的缺陷及其产生原因,并指导以后该如何避免类似错误,谢谢!


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发表于 2013-5-18 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请说明你电泳的具体参数。
从胶上看我认为有以下两点明显不足：
1.等电聚焦时间不够，蛋白点没分开，或横条严重——延长聚焦时间（请问你等电聚焦高压能不能上去？）
2.背景很脏。如果不是银染的问题，就应给从水质上考虑了——最好用MINIQ水
我也在摸索中，不是高手，希望以上的对你有用
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发表于 2013-5-18 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

血清中的蛋白成分不是特别多,所以你的点较少,还是比较客观的.从你的图上看有一个含量非常高的蛋白点存在,粗略估计占了整个含量的50一半以上,我推测这个蛋白点应该是白蛋白.因为血清按总蛋白分划的正常值比例 :α1-球蛋白2．0～4．8% α2-球蛋白6．1～11．0% β-球蛋白 6．7～10．3%γ-球蛋白 9．7～22．1% 白蛋白 57～71%.
你这个高峰度的蛋白存在严重影响了你的上样量和其他蛋白的展示.该蛋白含量过高,导致其有严重的水平条纹存在,这是不可避免的,也正是由于其含量,比例过高,造成其他蛋白含量相对不足.可能一些低含量蛋白无法展示.
你能否在IEF之前将白蛋白祛除,这样的话不但能够提高其他蛋白上样量,增加点的数量,同时也会使你的图象质量有提高的.
另外,你的胶银染背景比较深,而且背景不均一.提示你配胶或者染色过程水或者试剂的质量不是很好.建议你用去离子水,同时染色时更加注意
祝成功!
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发表于 2013-5-18 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那个严重的横条纹应该和聚焦关系不太大,是因为该蛋白(我推测是白蛋白)的含量太大造成的.一种蛋白占总蛋白含量这么高是很难聚好的.其他的点感觉还基本可以的.楼主不能简单通过提高上样量来提高图的质量.上样量越大,那个高峰度蛋白造成的影响越严重,建议IEF前祛除这个高峰度蛋白.我不是临床专业不太清楚有没有祛除白蛋白的方法.希望大家讨论
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发表于 2013-5-18 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
结核
楼主是新手,所以很在意胶.其实2-DE胶是客观的展示样品蛋白的分布,各个蛋白点分布是和你的样品相关的,你不能只追求视觉上的美观,而更应该追求客观的结果.更重要的是根据客观的结果去分析.有些样品的蛋白成分比较特殊,展现的结果永远不会很理想.我最近做结核分支杆菌,TB的2-DE图就很难看,我有PH3-10的24厘米胶条,由于TB的绝大部分蛋白都是酸性蛋白.整个胶80%以上的蛋白全集中在了PH4-5之间,所以一张图左边黑糊糊的一大片,整个右边很干净.感觉很别扭.但是你不能说是胶跑的不好,对吧.就需要想别的办法了.我现在改用PH4-7的胶条了,展示能力大大提高了,感觉很好了.我觉得就你这张胶本身来说问题不是很大,毕竟你的样品很特殊,展示出来就是这样的效果.如果你只是认为简单的优化一下实验条件就可以的话,那结果不会有很大的改善.祛除高峰度蛋白的建议你可以考虑.希望你多从你的样品特点考虑,想出更好的解决办法
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发表于 2013-5-18 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这是一张考染的胶,背景确实很脏乱,考染时是过夜的,不知道背景脏乱是否和染色时间过长有关?另外我用的是Millopre的水做的,试剂用的是国产的分析纯,不知道是否会有影响?非常感谢上述朋友的指点!
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 小中大
考染最好不要染太久,染色液要过滤,染色时要摇动,不要长时间静置.一般来说染色时间1-2小时足够.我们染色的试剂都是国产的.其实考染要求不是特别高,但是染成你这样就要注意了.
建议你采用银染分析(记得减少上样.考染的1/5左右)
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发表于 2013-5-18 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在上述各位战友的指点下,我用试剂盒祛除白蛋白/IgG后,重新跑胶,结果如下,不知道现在这张胶还有什么缺点或不足(上样量是否合适?我现在做的是考染,如果做银染,上样量是否要减少?减少多少合适?第二向跑胶时间是否可以再长点?)


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 小中大

感觉点还是太少，不知你考染上样量多少，应该可以加大上样量
我做过血清样品银染，点明显要多的多
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发表于 2013-5-18 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这里点少的原因我想可能是考染不如银染敏感的原因吧,改用银染应当会显示出更多的点来,不知道我这样的理解是否正确?
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