蛋白质与蛋白组学

我最近也在用碧云天的cleaved caspase 3，感觉还算正常。会有两条带。但这个抗体我才做了2次，暂时还没遇到楼主说的这个情况。我会留意的。

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你好，我是用的抗体是CST（9664）的cleaved caspase-3（17/19kD），没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3（35kD）
组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
上样量：为60微克/lane；10%的胶（细胞色素C14kD跑出来了，但cleaved caspase-3没出来）
电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2（我同时跑的两块胶，胶总面积为16.6cm2，所以我转膜的电流为16mA），时间按照分子量定（1min/kD），选择了19min
封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
洗膜：PBST洗10min*3遍
显色：ECL显色

注：1.同样的胶和转膜方法， 同时做的细胞色素C（14kD）就做出来了，不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的，不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来，

实验老是做不出来，也怕被怕被老板说，着急啊~~~~
你能给我说一下你的实验步骤吗？非常感谢~~~~

你好，我是用的抗体是CST（9664）的cleaved caspase-3（17/19kD），没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3（35kD）
组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
上样量：为60微克/lane；10%的胶（细胞色素C14kD跑出来了，但cleaved caspase-3没出来）
电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2（我同时跑的两块胶，胶总面积为16.6cm2，所以我转膜的电流为16mA），时间按照分子量定（1min/kD），选择了19min
封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
洗膜：PBST洗10min*3遍
显色：ECL显色

注：1.同样的胶和转膜方法， 同时做的细胞色素C（14kD）就做出来了，不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的，不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来，

实验老是做不出来，也怕被怕被老板说，着急啊~~~~
你能给我说一下你的实验步骤吗？非常感谢~~~~

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也有可能就是没有啊。cleaved caspase3本来就很少啊。如果非要说改进步骤的话，建议4°摇晃过夜试试。

也有可能就是没有啊。cleaved caspase3本来就很少啊。如果非要说改进步骤的话，建议4°摇晃过夜试试。

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请问你上样量是多少？谢谢~~

也有可能就是没有啊。cleaved caspase3本来就很少啊。如果非要说改进步骤的话，建议4°摇晃过夜试试。

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可以分享一下你的实验条件吗
感觉确实很难做

可以分享一下你的实验条件吗
感觉确实很难做

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关键是提完蛋白马上做，一抗孵育的时候一定要4°摇晃过夜，甚至孵育两天也可以。

关键是提完蛋白马上做，一抗孵育的时候一定要4°摇晃过夜，甚至孵育两天也可以。

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非常感谢你的回复！
确实这个要做崩溃了
我一般提了蛋白 煮了保存-20
一周内做几次，把这批蛋白做完
提完蛋白马上做 是指的连冻都不要冻吗？

非常感谢你的回复！
确实这个要做崩溃了
我一般提了蛋白 煮了保存-20

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一周内做几次，把这批蛋白做完
提完蛋白马上做 是指的连冻都不要冻吗？
提完蛋白到底要不要煮，这个问题我也一直在困惑，不敢妄下定论。按道理说WB跑的变性蛋白，所以加LB煮煮再保存是没有问题的。另外，提蛋白所有器械都要高压消毒，你就按照提RNA的清洁水平来提蛋白就行了，经验表明这样非常有效。一周以内做完是最好的，不能超过7天，因为cleaved-caspase-3本来含量就极少，必然是最先降解的，所以我说提完之后马上做是最理想的。关于判断蛋白降解我个人有个小小的经验，就是看管家蛋白的条带粗细，如果管家蛋白粗的话，说明蛋白样品良好，如果变得很细很细，那就是蛋白样品降解了。

还有就是4度摇晃过夜是非常必要的。把抗体配到5ml，和膜一起放到小培养皿或什么地方，4°摇晃过夜。