小中大有还原烷基化蛋白质消化操作流程
华大培训材料
1. 将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中,并记录点号及相应的位置；
2. 加50μL DD.H2O 洗两次，10min/次；
3. 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；
4. 重复步骤3，直至蓝色褪去；
5. 加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；
6. 加10 mM DTT（10μL 1M DTT，990μL 25mM NH4HCO3配制） 20μL，56℃水浴1hr；
7. 冷却到室温后，吸干，快速加55 mM IAM （55μL 1M IAM，945μL 25mM NH4HCO3配制）20μL，置于暗室45min；
8. 依次用25 mM NH4HCO3、50％乙腈溶液和乙腈洗，乙腈脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干5min；
9. 将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃，消化过夜；
10. 加入2%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。
说明:
1.每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。
2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。
3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子。
4．银染蛋白质点胶内消化不要脱色，步骤3、4省略。
双向电泳考染点无还原烷基化胶内消化操作流程
1． 将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板中, 并记录点号及相应的位置；
2．加30μL DD.H2O 洗两次，10min/次；
3． 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液30μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；
4．重复步骤3，直至蓝色褪去；
5．加乙腈30μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；
6．将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加2μL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃，消化过夜；
7．加入2%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。
说明:
1. 每加一次溶液都要漩涡振荡，胶粒要完全浸没在溶液中，进行下一步操作前要把溶液吸走。
2．如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色，使用的各种溶液的量也相应增加。
3．实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净，防止角蛋白污染，并带口罩和帽子。
全蛋白溶液消化操作规程
一、 试剂：
1． 变性缓冲液：6M Guanidine-HCl，50mM Tris-HCl,(pH8.0)或6-8M 尿素，50mM Tris-HCl,(pH8.0)
2． 1M DTT
3． 1M IAM
4． 50mM NH4HCO3(pH7.8)
5． Trypsin酶
二、 操作步骤：
1． 将蛋白溶解于6M Guanidine-HCl或6-8M 尿素或0.1% SDS, 50mM Tris-HCl,(pH8.0);
2． 往溶液中加入1M DTT至终浓度2-5mM;
3． 95℃加热15-20min或者60℃加热45-60min，冷却至室温；
4． 加入1M IAM至终浓度10-25mM，室温暗处孵育45min；
5． 加入50mM NH4HCO3(pH7.8)稀释Guanidine-HCl或尿素至终浓度不超过1M；
6． 按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1：20-1：100之间，加入酶液，37℃孵育8-12Hr;
7． 再次加入同等剂量的Trypsin酶溶液，室温孵育24Hr；
8． 浓缩样品到合适的体积。
注意事项：
1．样品中避免存在以下常见的胰蛋白酶抑制剂
Antipain (50µg/ml), antithrombin (1unit/ml), APMSF (0.01–0.04mg/ml), aprotinin
(0.06–2µg/ml), leupeptin (0.5µg/ml), PMSF (17–170µg/ml), TLCK (37–50µg/ml),
trypsin inhibitors (10–100µg/ml).
