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标题:【求助】western 和ELISA 处理样本有何差别?

uuooii[使用道具]
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【求助】western 和ELISA 处理样本有何差别?


我做的是老鼠脑组织匀浆,ELISA方法测定匀浆中IL-6的浓度,但是小弟是实验新手不知道这种组织匀浆怎样制备啊?要求的浓度是多少?要不要加溶细胞的酶?用什么做匀浆介质啊?
此外请教 匀浆之后,能测得出IL-6吗?

疑惑:western 和ELISA 处理样本有何差别?

同时我需要Western blot测定另一种蛋白。提取总蛋白后进行跑电泳,这个做过。
谢谢哦,急!
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Western Blot 样品制备要加蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制剂),然后冰上研磨,收集于EP管,冰上裂解30min,4度12000rpm离心15min,取上清分装,即得到蛋白样品。建议直接电泳,多余的-80保存。建议分装的蛋白每支略多于一次上样量,一次性用完一支,避免反复冻融。

ELISA样品,直接脑组织冰上匀浆,收集于EP管,同上一样离心,大约220-250ul每支分装(因为ELISA上样量基本都是每孔100ul,做复孔,每个样品2孔,就需要200ul,为了避免不够2孔,分装时要大于200ul每支),直接实验。多余的-80保存,一样避免反复冻融。
不过ELISA最好少量样品进行预实验,或者查阅文献,看看大概组织里有多高浓度,选择合适的试剂盒,测量范围要与组织浓度相符。避免浓度过高测量不准,或者浓度过低,小于试剂盒最低可测浓度。
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wood533[使用道具]
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western 样品先加裂解液和蛋白酶抑制剂匀浆后,冰上裂解30min,离心去除沉淀12000rpm,30min。得到的蛋白样品要用BCA活其他的试剂盒测浓度后,加入loading和裂解液调齐浓度。100度煮10min,蛋白变性后才能上样。因为western电泳是根据蛋白分子量差异分离蛋白的。电荷和三维结构的不同对电泳有影响。

ELISA的样品也是加裂解液,离心后可以根据预实验的结果看浓度范围(标曲范围),决定是否需要稀释。不用单独测浓度,也不需要加热变性,直接测试。
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hold住[使用道具]
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一、目的
虽然两者都是通过抗原抗体反应对蛋白质进行检测,WB主要还是定性,Elisa可以定性,也可以定量。
WB所检测的一般是抗原,而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小,或是否是多聚体、降解产物等,一句话,WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的;而Elisa无能为力,一锅端了。

二、模式
WB是(抗原-抗体-二抗酶)模式进行检测;Elisa模式有多种,如(抗原-抗体-二抗酶)、(抗原-抗体-抗原酶)、(抗抗体-抗体-抗原酶)、(抗体-抗原-抗体酶)、(抗抗体-抗体-抗原-抗体酶)等等很多很多。

三、抗体的适用性
WB所适用的一抗一般是线性位点的,ELISA线性或构象型抗体都可以使用。从另一个意义上讲,WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定,而Elisa不行。

四、灵敏度
一般Elisa的灵敏度要远高于WB,这从一般酶标记物的使用浓度或待检样品的稀释度上就可以看出。

五、可操作性
WB一次处理量就是一块胶版,10-20个样品最多了。Elisa一块96孔板一次可以处理96个样本,可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。
WB操作常见的非特异性条带,膜本底差,显色不好等等缺点在Elisa上表现得要好得多。

六、商品化度
WB不管怎样,都要自己先做电泳。而Elisa有很多成熟的商品化试剂盒了,只要不怕花钱,检测要方便快捷得多。
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wood533[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 hold住 于 2013-5-21 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一、目的
虽然两者都是通过抗原抗体反应对蛋白质进行检测,WB主要还是定性,Elisa可以定性,也可以定量。
WB所检测的一般是抗原,而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小,或是否是多聚体、降解产 ...

western 和ELISA 处理样本有何差别?
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wood533[使用道具]
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原帖由 hold住 于 2013-5-21 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一、目的
虽然两者都是通过抗原抗体反应对蛋白质进行检测,WB主要还是定性,Elisa可以定性,也可以定量。
WB所检测的一般是抗原,而Elisa抗原抗体都可以检测。
WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小,或是否是多聚体、降解产 ...

没有回答我的关键问题:
做试验中!疑惑:western 和ELISA 处理 组织的 蛋白样本时到底有何差别?
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qianqin1977[使用道具]
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回答楼主:其实提蛋白的时候是一样的,没什么差别。就是匀浆,冰上裂解静置,再离心。不同的是,western上样之前要加入loading buffer加热煮沸变性,ELISA直接上样就行(如果浓度合适)。
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回答楼主:其实提蛋白的时候是一样的,没什么差别。就是匀浆,冰上裂解静置,再离心。不同的是,western上样之前要加入loading buffer加热煮沸变性,ELISA直接上样就行(如果浓度合适)。

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学习了,最近也是准备做WB和ELISA,心房组织匀浆做ELISA,打算用ELISA的结果做蛋白表达统计,但是现在都要求用两种不同方法验证,是不是需要同时做WB和ELISA,要想用WB做统计的话,需要多少个样本?
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wb最好重复3次,ELISA至少要有每组样至少3个吧,都要有复孔。
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