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标题:【求助】蛋白变性后保存，再次上样前忘了变形了

gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-5-21 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白变性后保存，再次上样前忘了变形了


做WB，蛋白变性后放-20°C冰箱一周，再拿出来上样，忘了再次煮沸变性了，但是样本已经上了，不知道可不可以啊？！！！还有多克隆的GAPDH的内参都是用什么封闭呢？怎么用脱脂奶粉一直做不出来条带呢？求助求助！！！
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发表于 2013-5-21 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不用再次煮沸变性也可以的，GAPDH用5%脱脂奶粉就行了啊，不过不要用水配，要用TBST配的。还有就是奶粉一定要用脱脂的，有的包装上写的脱脂也不一定能用的。我们以前用的是光明的奶粉。
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发表于 2013-5-21 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我之前有看过资料说如果第二天就上样的话可以不用再次变性，如果隔的时间比较长就得再次变性，但具体的时间不知道。我之前一直都是用5%的脱脂奶粉做的，牌子是BD的，封闭时间是90min，但是好几次都做不出来或者条带很淡，请教过abcam的一个博士说是GAPDH要用BSA，纠结啊……还是做不出来
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发表于 2013-5-21 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 gmjghh 于 2013-5-21 18:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我之前有看过资料说如果第二天就上样的话可以不用再次变性，如果隔的时间比较长就得再次变性，但具体的时间不知道。我之前一直都是用5%的脱脂奶粉做的，牌子是BD的，封闭时间是90min，但是好几次都做不出来或者条带很淡，请教过a ...

样品是什么？上样量多少？ 丽春红染膜是否有条带？

对大部分抗体来说5%脱脂奶和3% BSA的区别也就是背景干净程度不同，GAPDH之类的内参抗体大部分都不差，应该是之前操作的原因。
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gmjghh[使用道具]
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 小中大

样品是肠组织标本，上样量60ug，丽春红染色在marker 72kd处条带最清晰，整个膜都可以看到蛋白的条带。但奇怪的是跑胶的时候溴酚蓝跑到后来很散很淡，跟我们一起跑的同学的溴酚蓝跑到最后都是整整齐齐的很亮的一条带，而且我们的Marker老是上面，也就是分子量大的跑的长一点，分子量小的跑的短一点，奇怪的很


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发表于 2013-5-21 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、已经变性的蛋白样品再次跑胶是可以不必重复变性。高温下的蛋白变性是不可逆的。
2、GAPDH我们实验室也在做，5%脱脂奶粉，用PBST配制，室温封闭一小时，可以看到清晰漂亮的条带。楼主可以借别人一点beta-actin的抗体试一下，看看能否曝出条带，如果可以，说明你手里的GAPDH的抗体不好用；如果还是不行，怀疑可能是样品制备有问题。
3、关于楼主说的跑胶的问题，跟你们一起跑的同学跟你们用的而是一样的东西么？我有点怀疑你们的SDS过期了。。。
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-5-21 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS是新买的，不超过三个月，应该不会；GAPDH是买的国产贤至的，在网上看的说是很好，可现在一抗浓度调到1:200还是出不来条带，难道真的是抗体的问题？
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发表于 2013-5-21 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我第一次跑western的时候忘记变性了居然也跑出条带了。。。。很神奇有木有。。。。

不过国产的东西用的需要有点挑战性，我建议你可以用进口分装的也不贵，我现在用的B-actin就是分装的，条带比santa的亮多了，我用的是2%BSA稀释的抗体
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-5-21 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家的内参都买什么牌子的哦？我觉得内参很重要，只要做WB就用得到，但刚开始做的时候听同学说容易就做的出来，国产的完全够用了，但是我却一直做啊做啊，改啊改啊，就是做不出WB条带来……既然不是变性、SDS也不是封闭液的问题，丽春红也有条带，难道真的是一抗？？明天看结果
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applebook=213[使用道具]
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发表于 2013-5-21 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 gmjghh 于 2013-5-21 18:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

大家的内参都买什么牌子的哦？我觉得内参很重要，只要做WB就用得到，但刚开始做的时候听同学说容易就做的出来，国产的完全够用了，但是我却一直做啊做啊，改啊改啊，就是做不出WB条带来……既然不是变性、SDS也不是封闭液的问题，丽 ...

一抗可以用点杂交的方式验证有效性, 不过内参抗体用的人成千上万, 很少出问题

我觉得你的问题出在跑胶到转膜的过程中
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