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标题:【求助】透析袋的使用

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】透析袋的使用


我的包涵体纯化之后，要透析除去其中的EDTA，然后做Pull-down，我看了下书，说透析袋使用前要用含碳酸氢钠和EDTA的溶液煮沸，然后用蒸馏水洗干净，再次用EDTA煮沸，请问所有的透析袋买来后使用前都是要这样处理么？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是透析袋工艺不过关那时候的老经验，现在很多大厂的透析袋如pierce明确说明不用煮，用纯水冲干净即可
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发表于 2013-5-23 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tianmei001 于 2013-5-23 11:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这是透析袋工艺不过关那时候的老经验，现在很多大厂的透析袋如pierce明确说明不用煮，用纯水冲干净即可

如果没有特别说明还是要按照老方法煮哈？？？
如果直接用水冲，那怎么算是冲干净呢？冲之前要不要用蒸馏水煮一下a啊？冲干净之后是不是要一直保存在水中然后用的时候直接取了用？/？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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如果没有特别说明还是要按照老方法煮哈？？？
如果直接用水冲，那怎么算是冲干净呢？冲之前要不要用蒸馏水煮一下a啊？冲干净之后是不是要一直保存在水中然后用的时候直接取了用？/？

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用EDTA煮其实也就是为了去除残留的重金属离子，煮过的透析袋用灭菌水泡几次应该就可以了。透析主要怕的是氧化和长菌，如果你提取的蛋白不受影响的话可以加0.02%叠氮钠。
润湿过的透析袋最好不要晾干。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用EDTA煮其实也就是为了去除残留的重金属离子，煮过的透析袋用灭菌水泡几次应该就可以了。透析主要怕的是氧化和长菌，如果你提取的蛋白不受影响的话可以加0.02%叠氮钠。

润湿过的透析袋最好不要晾干。

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你好，我这两天用透析袋透析了5ml蛋白，蛋白是包涵体，用8M尿素溶的，然后分别用6M、4M、2M浓度梯度各透析2h，最后用TBS透析过夜，大概透析4h左右时，透析袋里就有絮状白色物质产生，我怀疑是蛋白析出了，请问一下，怎样能避免蛋白析出呢？？？是我的体系问题还是浓度梯度问题呢？？透析液还可以重复利用么？？
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发表于 2013-5-23 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚好在做复性，分享下自己的经验：
复性时，蛋白浓度不要过高，0.1mg/ml左右为好；
预测下你的蛋白有无二硫键，如果有的话，需要加入还原剂如DTT， GSH等,以及氧化剂GSSG，构成一个氧化还原体系，使得蛋白能够正确的折叠，还原和氧化剂的比例一般在10：1～5：1，需要摸索。
可以加入甘油，精氨酸等，有助与稳定蛋白，使蛋白可溶。
透析是在低温环境下，而且越往后，Urea浓度越低时，梯度跨度要适当减少，如2M>1M>0.5M......

希望对你的实验有帮助。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 one 于 2013-5-23 11:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

刚好在做复性，分享下自己的经验：
复性时，蛋白浓度不要过高，0.1mg/ml左右为好；
预测下你的蛋白有无二硫键，如果有的话，需要加入还原剂如DTT， GSH等,以及氧化剂GSSG，构成一个氧化还原体系，使得蛋白能够正确的折叠，还原和氧化剂的 ...

那就是出现沉淀是不好的情况了？？我在纯化包涵体时加入了DTT和甘油，只是最后溶解时只有纯的8M尿素。透析时我是在室温下透析的，主要是怕尿素析出来。至于梯度的问题，您看我的梯度设计的是跨度太大还是要在增加一些梯度呢？？我透析5毫升的蛋白，用500毫升的尿素透析液（我的尿素是用PBS配的），这样的比例可以么？？还有，那个透析液可以重复利用么？因为配一次，还需要挺多尿素的
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我说的不是在纯化包涵体时加DTT和甘油，当然在包涵体洗涤阶段，加入适量的甘油和DTT，EDTA可以有助于洗脱杂蛋白和包涵体的溶解。
如果你的蛋白含有二硫键，那么在复性过程中也是需要还原剂和氧化剂构成一个氧化还原的体系，而你在把Urea去除的过程，就是蛋白重新折叠复性的过程。
你的5毫升蛋白用500毫升透析液应该是足够了，但是有一个问题是你5毫升蛋白浓度是多少，不要太高。

8M Urea在4摄氏度环境下，是不会析出的，这个你完全可先做实验验证。
透析液重复利用倒不是问题，也可以新配，Urea价格也不贵。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我说的不是在纯化包涵体时加DTT和甘油，当然在包涵体洗涤阶段，加入适量的甘油和DTT，EDTA可以有助于洗脱杂蛋白和包涵体的溶解。
如果你的蛋白含有二硫键，那么在复性过程中也是需要还原剂和氧化剂构成一个氧化还原的体系，而你在把Urea去除的过程，就是蛋白重新折叠复性的过程。
你的5毫升蛋白用500毫升透析液应该是足够了，但是有一个问题是你5毫升蛋白浓度是多少，不要太高。

8M Urea在4摄氏度环境下，是不会析出的，这个你完全可先做实验验证。
透析液重复利用倒不是问题，也可以新配，Urea价格也不贵。

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我透析的目的是为了去除蛋白中残留的EDTA，因为做Pull-down的试剂盒说明书上说明，蛋白挂柱前要去除EDTA。我洗涤和重悬包涵体的溶液都含有EDTA，因此要透析去除。（其实我在想如果纯化包涵体的溶液中不加EDTA会对纯化有影响么？如果影响不大，就省去透析这一步了呀）

那如果要加DTT和甘油，那么是加在透析液中还是蛋白溶液里呢？？与蛋白溶液的比例怎么确定呢？？

再退一步说，析出的蛋白沉淀，离心后再次用8M尿素溶解，不可以么？？？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-5-23 11:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DTT和甘油应该加到透析液中。

建议你先去预测下蛋白的结构，看看是否存在二硫键。如果存在二硫键，DTT是必须的。
至于浓度，可以从低到高摸索下，不同蛋白的性质不同，不好说。
甘油可以考虑5%~20%范围，以起到保护蛋白作用为好。
当然不同蛋白性质不同，没一个很确定的方法，都是要慢慢摸索。

开始我以为蛋白复性是很简单的，但是做下来是很复杂的，好不容易蛋白复性不沉淀了，但是却没活性，又要重新调整透析液的配方～～so，要有打持久战的准备。
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