【求助】Western blot 背景太深怎么办？

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标题:【求助】Western blot 背景太深怎么办？

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一次做Western blot，之前摸索过电泳，转膜的条件，染色后显示转膜比较成功，条带清晰，昨天转膜后用5%脱脂牛奶进行封闭，室温2h，随后洗膜5min*3次，用封闭液稀释一抗1：1000（Abcom公司），4度过夜，洗膜5min*3次，再加入二抗1：2000，室温2h，洗膜5min*3次。显色我是用ECL试剂，曝光1min，显影4-5min，定影8min，结果在暗室里就能看到整张膜发亮，定影后膜的位置一片黑色，都不知道有没有条带，这是为什么呢？怎么办？

箭头儿[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 土豆potato 于 2013-5-23 13:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次做Western blot，之前摸索过电泳，转膜的条件，染色后显示转膜比较成功，条带清晰，昨天转膜后用5%脱脂牛奶进行封闭，室温2h，随后洗膜5min*3次，用封闭液稀释一抗1：1000（Abcom公司），4度过夜，洗膜5min*3次，再加入二抗1：2000，室温2h，洗 ...

有答案cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5936631&sty=1&tpg=2&age=0')
原因和解决方案很详细

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 箭头儿的帖子

谢谢，但是我相同条件下做的内参却有明显的条带。同时，另一张膜我是封闭过夜，有24h，一抗过夜，但用的是上次回收的，就4度放了1天。二抗还是2h，每次的洗脱时间我增加为15min，3次，曝光30s，1min，3min，5min，10min。显影2min，结果却发现除了5min的目的蛋白有条带显出，其余包括内参都是一片空白了。而且5min目的蛋白显出的同时，还显出了明显的蛋白泳道间隙，呈竖直黑线，两天的结果反差也太大了吧，应该怎么办？谢谢

c86v[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的问题很简单，就是technical的问题。
抗体孵育稍微过了些，尤其是二抗，浓度太高，孵育太久。
曝光也得多联系下。
反正问题不大，多练习几次就行了。

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般二抗都是孵育多久比较好呢？我前一天内参二抗孵育2h，曝光3-5min，有条带，第二天同样孵育2h，曝光3-5min，什么都没有了。。。。

xue258[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 土豆potato 于 2013-5-23 13:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一般二抗都是孵育多久比较好呢？我前一天内参二抗孵育2h，曝光3-5min，有条带，第二天同样孵育2h，曝光3-5min，什么都没有了。。。。

1.一抗4度过夜，大约12-16h
2.二抗1h就可以，TBST10min×3
3.曝光30s足够，可以随时拿出来观察，以确定背景深浅。

土豆potato[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

减少2抗时间洗膜5min*3次改为洗膜10min*3次试试

xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2013-5-23 13:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

二抗的浓度可以再降一下。

66小飞侠[使用道具]
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